荔枝古树EC离体保存优化及其SOD克隆与启动子功能验证

摘要

福州西禅寺的“宋荔”是最负盛名的荔枝古树之一，也是西禅寺重要的景观之一，具有很高的园林观赏价值；同时，由于其历经千年，是一座优良的荔枝“基因库”。因此，本研究以荔枝古树“宋荔”为材料，在前人的基础上，进行荔枝古树胚性愈伤组织（embryogenic callus，EC）体胚发生和离体保存条件优化；进一步克隆荔枝古树EC SOD家族基因成员，分离5‘侧翼序列，并对所得5‘侧翼序列进行生物信息学顺式元件分析和部分启动子的功能验证，为探讨SOD基因家族在荔枝古树EC体胚发生和离体保存的分子机制，以便更全面地研究LcSODs在荔枝古树原生境下应对逆境胁迫的作用机制奠定基础，也为荔枝古树保护提供科学依据。本研究主要结果如下：
　　1荔枝古树EC体胚发生和离体保存优化
　　1.1、荔枝古树EC体胚发生条件的优化
　　以“宋荔”的胚性愈伤组织（EC）为试验材料，采用不同浓度的KT、NAA、和ZT进行正交试验，探讨荔枝古树EC体胚发生的优化条件。结果表明：在常规离体保存温度25±2℃，采用MS+0.5 mg/L KT+0.1 mg/L NAA+3.0 mg/L ZT+50 g/L蔗糖+10 g/L琼脂， pH5.8的培养基条件下暗培养35天可获得高频率的荔枝古树EC的体胚。其中ZT促进荔枝古树EC的体胚发生影响最显著，而KT影响不显著，但适量的KT和NAA组合对荔枝古树EC的体胚发生有一定的促进作用。
　　1.2、荔枝古树EC离体保存条件的优化
　　以“宋荔”的胚性愈伤组织（EC）为试验材料，采用不同浓度的PP333、肌醇和MS的大量元素进行正交试验，探讨荔枝古树EC的限制生长保存条件。结果表明：在常规离体保存温度25±2℃，采用3/4MS+10 mg/L PP333+300 mg/L肌醇+1.0 mg/L2.4-D+20 g/L蔗糖+7 g/L琼脂，pH5.8的培养基条件下弱光培养保存100 d后，其胚性愈伤组织的生长量最高且同时还能维持较高的细胞活性。适量的PP333、肌醇和MS培养基中大量元素的含量对荔枝古树EC的限制生长保存都起一定的促进作用。
　　2、荔枝古树EC SOD基因家族其它成员cDNA和DNA克隆及生物信息学分析
　　以“宋荔”的胚性愈伤组织（EC）为试验材料，在前人的基础上，采用RT-PCR和RACE法又成功获得了3个成员类型的8个mRNA转录本（包含可变剪接），完善了荔枝古树EC SOD家族成员的克隆。分别为 LcFe-SOD7a（KC492109）、LcFe-SOD7b（KC492110）、LcCu/Zn-SOD3（KF574007）、LcCu/Zn-SOD3a（KF574008）、LcCu/Zn-SOD3b（KF574009）、LcCu/Zn-SOD3c（KF574010）、LcCu/Zn-SOD4（KJ577742）和LcCu/Zn-SOD4-1（KJ577743）。其中LcFe-SOD7类型的两个转录本属可变剪接现象，LcFe-SOD7b相对LcFe-SOD7a插入了完整的第5个内含子，分别编码不同的蛋白质；LcCu/Zn-SOD4类型的两个转录本也属可变剪接现象，编码相同的蛋白质。而LcCu/Zn-SOD3类型的4个转录本属于3‘端的聚腺苷酸化现象，编码相同的蛋白质。
　　此外，试验还获得荔枝古树SOD基因家族中5个成员相应的基因组DNA序列，分别为LcFe-SOD1（JX878357）基因组全长为929 bp，由4个内含子和5个外显子组成；LcFe-SOD7（KC492127）基因组gDNA长2284 bp，由7个内含子和8个外显子组成；LcCu/Zn-SOD4（JX911315）基因组gDNA长1822 bp，由6个内含子和7个外显子组成；LcCu/Zn-SOD3（KF672186）基因组gDNA长为4196 bp，由6个内含子和7个外显子组成； LcMn-SOD（JX880085）基因组gDNA长1620 bp，由5个内含子和6个外显子组成。分析发现荔枝古树LcSODs不同成员之间内含子和外显子数量相对均匀，处于4-8之间，且大部分成员中都含有一个相对较长的内含子。
　　生物信息学分析表明：试验所得的荔枝古树SOD基因家族LcFe-SOD7a、LcFe-SOD7b、LcCu/Zn-SOD3和LcCu/Zn-SOD4编码的四种蛋白均属亲水、稳定蛋白，在一定程度功能相似又各有分工，其中同一类型蛋白之间更具保守性。其中LcFe-SOD7a和LcFe-SOD7b两个蛋白仅在末端上存在差异，均由α螺旋、β折叠和无规则卷曲组成；定位相同，主要定位在微体（过氧化物酶体）和细胞质中；倾向于N末端朝外的由外到内进行跨膜运动；并存在以酪氨酸为主，丝氨酸和苏氨酸为辅的磷酸化修饰。而LcCu/Zn-SOD3和LcCu/Zn-SOD4两个蛋白结构也高度相似，主要由β折叠和无规则卷曲组成，均不含有螺旋结构；也均主要定位在细胞质；且都不存在跨膜结构和有酪氨酸位点，并进行以丝氨酸为主、苏氨酸为辅的位点磷酸化修饰。
　　3、荔枝古树EC SOD基因家族成员启动子克隆及元件分析
　　为进一步了解荔枝古树EC SOD基因家族的调控影响因子，本研究采用Tail-PCR结合接头酶切法分离LcSODs基因家族不同成员的5’调控序列。分别获得LcFe-SOD1（JX878357）5’调控序列长为1126 bp；LcFe-SOD7（KC492127.2）5’调控序列长为865 bp；LcCu/Zn-SOD4的5’调控序列长为1447 bp；LcCu/Zn-SOD3（KF672186.1）5’调控序列长为1426 bp；LcMn-SOD（JX880085.2）5’调控序列长为2091 bp。其中LcFe-SOD1和LcCu/Zn-SOD4的5‘UTR中均含有内含子序列。PlantCare结合PLACE在线软件元件预测显示荔枝古树EC SOD基因家族的5’调控序列中除了均含有大量的TATA-box和CAAT-box核心元件外，还存在大量的光响应元件、激素应答元件、逆境应答元件、胚乳表达元件、细胞周期响应元件和大量的功能未知或功能特异元件。此外，荔枝古树LcSODs可能均受到不同程度的WRKY类转录因子的调控；LcCu/Zn-SOD3、LcCu/Zn-SOD4、LcFe-SOD7和LcMn-SOD基因可能还受MYB类转录因子的调控；而 LcCu/Zn-SOD4、LcFe-SOD1和LcMn-SOD基因可能还受bZIP类转录因子调控。
　　4、荔枝古树EC SOD基因家族部分启动子功能验证
　　为进一步分析克隆所获得的荔枝古树SOD基因家族的启动子功能，通过转化拟南芥分析表明：克隆所获得的LcCu/Zn-SOD3、LcFe-SOD7和不含内含子的LcCu/Zn-SOD4基因的5‘端启动子（均带有部分第一外显子序列）均可以驱动下游基因表达活性；且三条启动子在拟南芥植株的根、茎、叶中均有表达，表明LcCu/Zn-SOD3、LcCu/Zn-SOD4和LcFe-SOD7三条启动子均为组成型启动子。且不同胁迫处理表明，LcCu/Zn-SOD3、LcCu/Zn-SOD4和LcFe-SOD7三个成员的启动子均能不同程度的响应NaCl、PEG-6000、ABA、MeJA和损伤胁迫。
　　5、荔枝古树5'UTR中的内含子对LcCSD4启动子功能活性影响分析
　　分析发现在荔枝古树LcCu/Zn-SOD4基因组的5‘UTR中存在两个较长的内含子序列。为探讨该内含子对LcCu/Zn-SOD4基因启动子驱动活性的影响，本章构建了克隆获得的5‘侧翼全部序列驱动GUS基因的植物表达载体并进行瞬时表达和转化烟草永久表达分析。研究结果表明：在转录水平上，所得的阳性植株中该内含子并未被剪切，而是连接GUS序列一起作为下游基因序列参与转录；在翻译水平上，瞬时表达和永久表达均未检测到GUS染色。同时内含子序列中含有多个翻译起始位点和翻译终止子。即表明该内含子的存在对LcCu/Zn-SOD4基因启动子驱动下游基因的转录水平上可能无显著差异，但是在翻译水平上可能起着严重的抑制作用亦或是可能改变了下游基因的翻译起始位点而造成GUS基因不能正常翻译。

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第一章 引言

1 古树名木的景观价值及保护研究

2 植物种质资源保存

3 植物体胚发生的研究进展

4 植物启动子研究进展

5 植物SOD研究进展

6 本试验研究的意义与内容

第二章 荔枝古树EC体胚发生及离体保存优化研究

第一节 荔枝古树EC体胚发生优化研究

第二节 荔枝古树EC的离体保存优化研究

第三章 荔枝古树EC SOD基因和基因组的克隆及生物信息学分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第四章 荔枝古树EC SOD基因家族启动子的克隆及顺式元件分析

1 材料与方法

2结果与分析

3 讨论

第五章：荔枝古树EC SOD家族部分成员启动子功能验证

1 材料与试剂

2 实验方法

3 结果与分析

4 讨论

第六章：5'UTR中的内含子对LcCSD4启动子功能活性影响分析

1 材料与试剂

2 实验方法

3 结果与分析

4 讨论

小结

参考文献

附录1 图版及图版说明

附录2 GenBank 上登录的荔枝古树EC SOD基因家族的序列信息

致谢