斜纹夜蛾肠道细菌多样性及其对功能研究

摘要

斜纹夜蛾Spodoptera litura是世界性分布的害虫，主要危害十字花科、豆科、苋科、蓼科、茄科和菊科等109科的植物。斜纹夜蛾食性广、一年发生多代、对杀虫剂的抗性较强，防治难度大。昆虫肠道细菌在宿主取食、消化、免疫以及生长发育等方面都有重要的作用。本文利用传统微生物分离纯培养方法结合现代分子生物学技术，对斜纹夜蛾四龄幼虫肠道细菌多样性及其功能进行研究，期望通过阐明斜纹夜蛾肠道细菌的多样性及其与食性之间的关系，为防治斜纹夜蛾提供理论基础。主要研究结果如下：
　　1.斜纹夜蛾肠道细菌多样性
　　利用传统微生物分离纯培养、宏基因组测序、基于细菌16S rRNA作为分子标记的变性梯度凝胶电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE）以及实时荧光定量PCR（Real-Time Qu antitative PCR Detecting System qPCR）四种方法分析斜纹夜蛾肠道细菌的多样性。四种方法的研究结果均表明利用芋头叶饲养（Tar）和饲料饲养（Art）的两个品系的斜纹夜蛾四龄幼虫肠道细菌中变形菌门Proteobacteria是丰度最高的种群。宏基因组测序表明，在门的水平上，两个品系的肠道细菌差别不大，都是以变形菌门Proteobacteria和厚壁菌门Firmicutes为主。其中，Tar品系斜纹夜蛾肠道细菌变形菌门的丰度为86％，厚壁菌门的丰度为4%；Art品系斜纹夜蛾肠道细菌变形菌门的丰度为80%，厚壁菌门的丰度为5%。在目的分类等级上两个品系的肠道细菌多样性发生了较大的变化，Tar品系主要由肠杆菌目Enterobacteriales（83.67%）和乳杆菌目Lactobacillales（2.3%）组成；Art品系主要是由假单胞菌目Pseudomonadales（31.95%）和肠杆菌目Enterobacteriales（26.9%）组成。在科的水平上，Tar品系主要由肠杆菌科Enterobacteriaceae（83.7%）和肠球菌科Ente rococcaceae（1.5%）组成；Art品系则主要是由假单胞菌科Pseudomonadaceae（31.5%）和肠杆菌科Enterobacteriaceae（26.9%）组成。相比Tar品系，Art品系中假单胞菌科Pseudomonadaceae丰度大幅升高，而肠杆菌科Enterobacteriaceae丰度急剧下降，该结果表明取食不同食物的斜纹夜蛾肠道细菌多样性发生了变化，提示斜纹夜蛾肠道细菌的多样性较大程度的受到食物的影响。
　　2．斜纹夜蛾肠道细菌宏基因组分析
　　肠道细菌宏基因组测序结果表明斜纹夜蛾肠道细菌能够编码纤维素降解酶、木聚糖酶和果胶酶，CAZymes家族分析发现斜纹夜蛾肠道细菌涉及植物细胞壁多糖降解过程中酶家族成员的编码基因数量多达2465个。比鳞翅目昆虫的小菜蛾拥有更多的糖苷水解酶Glycoside hydrolase（GH），提示广食性昆虫的肠道细菌具备更强的糖苷降解功能。同时我们还发现斜纹夜蛾肠道细菌能够参与合成大量的必需氨基酸和非必需氨基酸，表明斜纹夜蛾肠道细菌可能在宿主营养供给上起到重要的作用。此外，在斜纹夜蛾肠道细菌宏基因组中还发现了完整的有氧降解苯酚的代谢途径，提示斜纹夜蛾的肠道细菌能够帮助宿主降解有毒物质，应对植物防御系统。
　　3．斜纹夜蛾肠道细菌对取食的影响
　　利用抗生素处理食物后让斜纹夜蛾四龄幼虫取食，分别测量斜纹夜蛾的五项营养指标：相对生长率、相对取食量、食物利用率、食物转化率、近似消耗率。实验结果表明，与对照组相比，抗生素处理组斜纹夜蛾的各项营养指标均发生了显著变化：相对生长率、相对取食量、食物利用率都显著的下降。抗生素处理后重新导入肠杆菌和全部肠道细菌，发现重新导入肠杆菌和全部肠道细菌的斜纹夜蛾的相对生长率、相对取食量、食物利用率都显著提高，而且导入全部肠道细菌的斜纹夜蛾较单纯导入肠杆菌的斜纹夜蛾其营养指标的提高程度更大。实验结果表明抗生素处理清除斜纹夜蛾肠道细菌后，影响了宿主的消化能力，对斜纹夜蛾幼虫的营养指标具有显著的影响。重新导入细菌后，相对生长率及相对取食量等营养指标趋于恢复，表明斜纹夜蛾肠道细菌对宿主的取食具有重要的作用。
　　斜纹夜蛾为我国重要农业害虫，每年给农业生产带来大量的损失。本研究首次解析了斜纹夜蛾肠道细菌的多样性，利用斜纹夜蛾肠道细菌宏基因组分析斜纹夜蛾肠道细菌参与食物消化、营养供给和代谢解毒的功能。同时验证了斜纹夜蛾肠道细菌对其宿主取食的影响，为从肠道细菌的角度进行斜纹夜蛾的生物防治提供了新的思路。

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1.绪论

1.1昆虫肠道微生物的研究概况

1.2昆虫肠道微生物多样性研究

1.3昆虫肠道微生物的功能

1.4肠道微生物的研究方法

1.5本研究的目的和意义

1.6技术路线

2材料方法

2.1主要试剂及主要仪器

2.2斜纹夜蛾的饲养

2.3斜纹夜蛾肠道细菌多样性分析

2.4宏基因组测序分析斜纹夜蛾肠道细菌的功能

2.5抗生素处理对斜纹夜蛾肠道细菌的影响

3结果与分析

3.1斜纹夜蛾肠道细菌多样性分析

3.2斜纹夜蛾肠道细菌功能研究

3.3抗生素处理对斜纹夜蛾肠道细菌的影响

4 总结与讨论

4.1斜纹夜蛾肠道细菌多样性

4.2斜纹夜蛾肠道细菌功能分析

4.3抗生素及肠道细菌对斜纹夜蛾取食的影响

参考文献

附录

致谢