利用CRISPR/Cas9技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统及其初步应用

摘要

随着人类对多个物种全基因组的相继解析，基因的功能性研究愈发重要。从20世纪80年代末兴起的基因打靶技术开始，越来越多的基因编辑技术被应用于基因功能的研究。CRISPR/Cas9基因敲除系统作为一种新型基因操控技术，可以精确、高效的对基因组进行敲除或者修饰，从而更好地完成基因功能研究。
　　aroA基因编码的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)是革兰氏阴性菌和阳性菌芳香族氨基酸生物合成途径中重要的酶，缺失该基因可对细菌的毒力产生明显的减弱作用。本研究旨在利用CRISPR/Cas9新型基因编辑技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统，并分析其对不同大肠杆菌aroA基因敲除、修复的差异，探讨利用该敲除系统对其它相关细菌aroA基因进行敲除修复的可行性，为进一步研究致病菌aroA基因功能及开发减毒大肠杆菌疫苗提供新型、有效的基因敲除工具。
　　通过比对分析不同大肠杆菌菌株aroA基因及其上下游序列，设计相应引物并构建靶向aroA基因的CRISPR/Cas9载体；鉴于原核生物大多缺乏非同源末端连接修复机制，可人工设计同源修复供体（Donor）基因序列，并亚克隆到CRISPR/Cas9载体中，构建成完整的CRISPR/Cas9基因敲除及同源修复的载体，即大肠杆菌aroA基因的CRISPR/Cas9基因敲除系统；通过质粒转化将该系统初步应用到大肠杆菌基因工程菌株DH10B、DH5α和JM109细胞中，利用双抗(氨苄和氯霉素)平板筛选双阳性菌株；PCR鉴定筛选到的双阳性菌株，选取初步鉴定敲除成功的菌，回收其PCR扩增条带进行TA克隆，并送检测序、分析；最后分别对筛选得到的基因缺失菌株进行细菌生长曲线的测定。CRISPR/Cas9载体的酶切鉴定与测序结果均符合预期，表明载体构建成功；利用双抗平板成功筛选出了含有CRISPR/Cas9载体的双抗性菌株；对筛选出的菌株进行的PCR鉴定结果显示，该系统对三种大肠杆菌均能进行aroA基因的有效敲除，敲除效率为46％~58%；测序结果显示，三种大肠杆菌aroA基因敲除后的同源修复位置均与构建的Donor序列一致，证实目的基因敲除成功，从而得到aroA基因缺失的菌株QDH10B(1)、QDH5α(1)和QJM109(1)；基因缺失菌株的生长曲线结果显示缺失菌和完整菌在生长上没有明显的变化，特别是在迟缓期和稳定期，表明对aroA基因位点进行的人工突变，对细菌的增殖能力没有明显的影响，同时说明了该突变是一种非致死性的细菌突变，对后续研究开发新型基因工程疫苗等意义重大。