水稻矮缩病毒非结构蛋白Pns10的介体互作因子的筛选与功能验证

摘要

水稻矮缩病毒（RDV）属于持久增殖型病毒，主要由介体黑尾叶蝉传播。在叶蝉内，病毒利用自身编码的非结构蛋白Pns10形成包裹病毒粒体的小管通道，采取“小管运输病毒”的策略进行安全扩散，以抵御叶蝉的各种免疫攻击。这种安全运输病毒策略需要介体蛋白共同参与才能顺利完成，先前研究表明Pns10通过酵母双杂交筛选到介体互作蛋白肌动蛋白（actin）、肌球蛋白（myosin）等，黑尾叶蝉胞质型actin与Pns10的特异性互作决定黑尾叶蝉专化性传播RDV，这些为Pns10互作介体蛋白的筛选提供了基础。
　　鉴于此，本研究继续利用核蛋白互作的Clontech酵母双杂交系统筛选数量相等的成虫和若虫的黑尾叶蝉cDNA库，获取阳性克隆。在NCBI Blastx进行序列比对分析后，预测筛选的基因功能多为与昆虫生长发育、细胞成分等相关，挑选6个可能互作的蛋白：原肌球调节蛋白（Tmod），线粒体孔蛋白（mitochondrial porin,Mito P），运脂蛋白前体（LP），高密度脂蛋白结合蛋白（Vigilin），凋亡诱导因子（AIF），卵黄原蛋白（Vg），将这6种蛋白的酵母质粒与pGBKT7-Pns10再次回转酵母感受态细胞AH109，确定Pns10与候选蛋白互作。双分子免疫荧光互补技术（BiFC），证明Tmod、Vg和LP与Pns10互作，而Mito P、AIF和vigilin与Pns10不互作。在本氏烟共定位表达系统中， Tmod和Vg，vigilin，LP均能与RDV Pns10共定位，而Mito P、AIF不与Pns10共定位。
　　为进一步明确6个候选蛋白在 RDV扩散中发挥的作用，利用RT-qPCR实验检测6个候选蛋白基因在带毒培养细胞和黑尾叶蝉中的相对表达量。结果表明除 Mito P与对照组无明显差别外，其余5个基因的相对表达量均高于对照组。
　　由于Tmod作为actin慢生长端的唯一盖帽蛋白，是actin的相关蛋白，而包裹病毒Pns10小管运动是沿着actin纤维丝进行病毒的运输。利用GST-Pull down实验证明Tmod能与RDV Pns10在体外发生特异性互作；Tmod荧光抗体免疫标记带毒培养细胞和黑尾叶蝉消化道，Tmod定位在微绒毛上，与Pns10共定位，Pns10小管能够穿出actin形成的微绒毛。RT-qPCR分析Tmod、Pns10、RDV P8在带毒叶蝉中的表达趋势相似。利用dsTmod抑制Tmod在介体中的表达，发现Tmod、Pns10和P8表达量明显下降。并且干扰Tmod表达的第14天，虫体的带毒率也下降了一半。因此， Tmod对Pns10行使功能有正调控作用，Pns10小管依赖于actin的小管动力（ABTM）充分利用Tmod在介体中的调控作用，以至于actin能够无限延伸，反向便捷了Pns10小管插入邻近细胞，甚至为突破介体组织膜屏障提供动力，最终实现病毒扩散。
　　Vg为卵黄蛋白前体，是卵发育的营养物质，在脂肪体上合成释放到血淋巴中，最终被卵巢吸收。利用GST-Pull down实验进一步确定Pns10与Vg互作。免疫荧光抗体标记培养细胞，发现Vg可与Pns10共定位。此外，Pns10与Vg还可在卵巢滤泡细胞、菌胞和卵巢管柄处共定位，但当Pns10与Vg大量共定位于卵巢管柄时，卵内并未标记到Pns10蛋白，因此推测卵巢管柄是RDV侵入卵的初侵染点，Vg与Pns10互作帮助了病毒在卵内的扩散。

目录

声明

1 前言

1.1 水稻矮缩病的分布、症状、危害

1. 2 病毒分类地位与粒体结构

1.3 RDV基因组主要功能

1.4 RDV的传播特性

1.5 RDV对寄主水稻和黑尾叶蝉的侵染

1.6 RDV在介体内的扩散机制

1.7 参与病毒扩散的介体互作蛋白

1.8 卵黄原蛋白（vitellogenin, Vg）

1.9 原肌球调节蛋白（tropomodulin, Tmod）

1.10本研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 实验方法

2.3 实验引物

3 结果与分析

3.1 酵母双杂交技术筛选黑尾叶蝉cDNA文库

3.2 候选介体蛋白与RDV Pns10的互作验证

3.3 RDV对候选蛋白基因的影响

3.4 Tmod与Pns10互作

3.5 Vg与Pns10互作

4 讨论

参考文献

攻读硕士学位期间参与发表的学术论文

致谢