闽北地区白羽肉鸡鸡毒支原体感染的病原学调查及其流行菌株的分离鉴定

摘要

鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum,MG）可以引起鸡的慢性呼吸道疾病（Chronic respiratory disease,CRD），临床主要表现为咳嗽、流浆液性鼻液、呼吸困难、湿性啰音，剖检可见到鼻道、气管卡他性渗出物和严重的气囊炎。该病病程长，发展缓慢，若无其他病原协同感染时，其死亡率较低，与新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和大肠杆菌等病原交叉感染时可引起较高的发病率和死亡率，是目前困扰我国规模化鸡只养殖的一大难题。闽北地区是福建省最大的白羽肉鸡养殖地区，但该地区尚未见MG感染病原学调查的相关报道，给该地区有效防制MG感染造成极大的盲目性。因此，本研究对闽北肉鸡养殖区开展MG感染调查，同时进行流行菌株的分离鉴定，通过分离菌株的药物敏感性试验和pvpA基因序列的测序分析比较，为其防制工作提供参考依据。 方法：本实验首先采用Real-time PCR对闽北地区白羽肉鸡MG感染情况开展调查；其次，选择适宜的支原体培养基从临床疑似CDR病鸡喉气管黏液棉拭子中分离培养及鉴定MG，并对临床分离株进行序列测定与比较分析；最后，选择临床常用的7种抗菌药物进行最低抑菌浓度试验（MIC）筛选临床MG分离株敏感的药物。 结果如下： (1)比较Real-time PCR检测喉气管拭子及肺脏组织样品的MG阳性率，结果显示喉气管拭子和肺脏组织样品的阳性检出率分别为28.12%和3.12%，表明喉气管拭子样品更适宜MG Real-time PCR检测。 (2)自2017年3月至2017年11月期间，从闽北地区对不同免疫背景及不同用途的90个白羽肉鸡养殖场采集1800份喉气管拭子样品，采用Real-time PCR进行MG检测，结果显示：进行过MG免疫的祖代场和父母代场种鸡场均未受到MG感染，未进行MG疫苗免疫的商品代白羽肉鸡场的MG感染阳性场的比率为33.33%，样本阳性率为13.17%，其中阳性场的阳性样本率最高为100%，最低为5%，平均值为39%。 (3)从临床样本中成功分离培养了2株支原体，经鉴定为MG，命名为MX分离株和HY分离株。 (4)通过pvpA基因部分核苷酸序列比对结果显示，MX和HY分离株的该段序列完全一致，与F株的核苷酸序列同源性为96.7%，有10处碱基不一致并且出现一处缺失3个碱基，推测的氨基酸序列同源性为92.2%，有10个氨基酸差异，其中缺失一个苏氨酸；与R株的核苷酸序列同源性为98.9%，推测的氨基酸序列同源性为98.0%，缺失DR1、DR2之间77个氨基酸序列；与CG5株的核苷酸序列同源性为90.9%，推测的氨基酸序列同源性为86.3%。遗传进化分析表明MX分离株和HY分离株与R株亲缘关系最近。 (5)动物回归试验结果显示，接种MX分离株液体培养液和HY分离株液体培养液的两组鸡只均出现明显的呼吸道症状，气囊均不同程度地表现出混浊、增厚和产生泡沫的病理变化；接种F疫苗株的组和空白对照组的鸡只生长发育良好，均未表现出明显的临床症状。 (6)根据体外药物敏感性试验结果显示，泰妙菌素均对MX分离株和HY分离株的抑菌效果最好，其次为泰乐菌素和氟苯尼考。 结论：闽北地区商品代白羽肉鸡MG感染的情况较为严重；从此地区分离的MX和HY分离株均具有一定的致病性；泰妙菌素、泰乐菌素和氟苯尼考为此地区防治CRD的首选药物。

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摘 要

结果如下：

(1) 比较Real-time PCR检测喉气管拭子及肺脏组织样品的MG阳性率，结果显示喉气管拭子和

(2) 自2017年3月至2017年11月期间，从闽北地区对不同免疫背景及不同用途的90个白羽肉鸡养

(3) 从临床样本中成功分离培养了2株支原体，经鉴定为MG，命名为MX分离株和HY分离株。

(4) 通过pvpA基因部分核苷酸序列比对结果显示，MX和HY分离株的该段序列完全一致，与F株的核苷

(5) 动物回归试验结果显示，接种MX分离株液体培养液和HY分离株液体培养液的两组鸡只均出现明显的呼

(6) 根据体外药物敏感性试验结果显示，泰妙菌素均对MX分离株和HY分离株的抑菌效果最好，其次为泰乐

结论：闽北地区商品代白羽肉鸡MG感染的情况较为严重；从此地区分离的MX和HY分离株均具有一定的致病性

ABSTRACT

Result:

(1)The positive rate of MG in laryngealtracheal swabs

(2)From March to November 2017, collect 1800 laryngot

(3)Two strain of Mycoplasma were isolated from laryng

(4)The comparing result of pvpA gene nucleotide seque

(5)The results of animal regression experiments showe

(6)In vitro drug sensitivity test of result showed th

Conclusion: The MG infection situation of commerci

KEYWORDS: Mycoplasma gallisepticum(MG)，Chronic res

英文缩略词对照表

第一章 综述

1 鸡毒支原体研究概况

2 鸡毒支原体病原学

2.1 分类地位

2.2 结构与形态学特征

2.3 培养特性与生化特性

2.4 抵抗力

3 临床症状及病理变化

4 致病机理

5 流行病学

6 诊断

6.1 病原学诊断

6.2 血清学鉴定

6.3 分子生物学诊断方法

7 防控

7.1 管理预防

7.2 疫苗免疫

8 本研究的意义

闽北地区是福建省最大的白羽肉鸡养殖地区，但该地区尚未见MG感染的病原学调查的相关报道，给该地区有效防

1 材料

1.1待测样品

1.2主要试剂

1.3主要仪器

2 方法

2.1 样品的采集

2.1.1 采集检测样品组织的选择

2.1.1 检测样品的采集

2.2 Real-time PCR鉴定

2.2.1 DNA提取

2.2.2 MG Real-time PCR检测

3 结果

3.1 采集不同部位的样本对MG感染检测结果的影响

3.2 MG感染情况检测结果

4 讨论

第三章 鸡毒支原体的分离鉴定与药物敏感性分析

1 材料

1.1 实验动物与病料

1.2主要试剂

1.3 MG培养基

1.3.1 牛心肌浸液的制备

1.3.2 改良Frey氏基础液的配制

1.3.3 MG液体培养基的制备

1.3.4 MG固体培养基的制备

1.4 主要仪器

2 方法

2.1 分离MG样品的采集与处理

2.2 MG的分离培养和初步鉴定

2.2.1 分离培养

2.2.2 细菌纯化

2.2.3 菌落形态观察及着色试验

2.2.4 细菌L型鉴定

2.2.5 鸡红细胞吸附试验

2.3 Real-time PCR鉴定

2.4 临床分离株α基因和pvpA基因的扩增与测序分析

2.4.1 引物设计

2.4.2 PCR扩增

2.4.3 电泳

2.4.4 PCR产物回收

2.4.5 pvpA基因测序及序列分析

2.5 动物回归试验

2.5.1 感染菌液制备

2.5.2 感染试验

2.5.3 临床症状观察

2.5.4 剖检病变观察

2.5.5 病理切片制作与观察

2.5.6 鸡毒支原体重新分离鉴定

2.6 药物敏感性试验

2.6.1 药物浓度配制

2.6.2 临床分离株培养液颜色变化单位（CCU）的测定

2.6.3 临床分离株最小抑菌浓度（MIC）的测定

3 结果

3.1 MG的临床分离及初步鉴定结果

3.2 临床分离株的实时荧光PCR结果

3.3 MG临床分离株α基因和pvpA基因部分片段的PCR扩增结果

3.4 MG临床分离株pvpA基因部分片段的测序结果

3.5 MG临床分离株pvpA基因序列比较分析结果

3.6 临床症状与病理变化

3.7 病理切片结果

3.8 动物试验MG重新分离鉴定结果

3.9 药物敏感性结果

4 讨论

4.1 MG的分离鉴定

4.2 临床分离株的pvpA基因测序与分析

4.3 临床分离株的致病性分析

4.4 临床分离株药物敏感性分析

1 结论

2 创新点

3 展望

致谢