RNA干扰BCK1基因治疗卡氏肺孢子肺炎的体外实验研究

摘要

本实验研究构建BCK1基因miRNA表达载体，转染体外提纯培养卡氏肺孢子(Pneumocystis carinii,PC)，通过观察其包囊增殖情况，电镜下观察转染后PC超微机构变化以及RT-PCR观察BCK1基因受干扰情况，初步探讨RNA干扰技术对体外培养PC的抑制效果。 方法：连续地塞米松皮下注射正常wistar大鼠6W，诱导卡氏肺孢子肺炎(Pneumocystis carinii pneumonia PCP)动物模型；依据siRNA设计原则，结合PC BCK1基因序列特征，借助生物学信息学软件在线设计两对靶向PC BCK1基因的siRNA。应用基因重组技术构建BCK1基因短发价状siRNA质粒干扰载体。提纯并体外培养PC细胞，利用脂质体将siRNA转染入PC细胞，同时设立GFP转染对照组、空质粒转染对照组、未经任何处理空白阴性对照组。根据每日荧光显微镜下观察荧光个数，选用最优转染方法；采用GMS染色，计数每日包囊数变化情况，根据每隔1d PC包囊计数情况，对不同组别，观察d数及重复次数等各因素进行多因素方差分析，使用统计软件SPSS计算出F值。作用72h后扫描电镜观察空白组及重组质粒转染组PC虫体超微结构变化情况，RT-PCR检测转染前后PC BCK1基因表达变化情况。 结果：成功建立卡氏肺孢子肺炎大鼠模型，成功构建2种BCK1siRNA真核表达载体，命名为BCK1-shRNA1和BCK1-shRNA2。转染体外培养PC经GMS染色并计数发现BCKl siRNA能够影响体外培养PC包囊的增殖，与空白对照组相比，BCK1-shRNA1和BCK1-shRNA2对PC增殖抑制率分别为35.4％和42.5％。通过扫描电镜观察可见siRNA真核表达载体组PC超微机构出现不同程度细胞壁破损等改变。RT-PCR结果发现BCK1基因mRNA表达发生抑制，BCK1-shRNA1和BCK1-shRNA2对PC mRNA表达的抑制率分别为57.38％～I 64.45％。 结论：BCK1 siRNA真核表达载体能通过有效干扰PC BCK1基因的复制和表达，并影响体外培养PC细胞的增殖，能够对PC细胞壁产生一定破坏作用。

目录

论文说明：英汉缩略语名词对照

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摘要

前言

第一部分PC BCK1基因shRNA设计与真核表达载体的构建以及转染方法的优化

1实验材料

2实验方法

3结果

4讨论

参考文献

第二部分BCK1-shRNA真核表达载体体外干扰BCK1基因表达的初步研究

1实验材料

2实验方法

3结 果

4讨论

参考文献

文献综述：卡氏肺孢子虫肺炎研究进展

致 谢

攻读学位期间发表的论文