一种卡氏肺孢子菌重组蛋白及其制备方法与应用

摘要

本发明涉及医疗技术领域，提供了一种卡氏肺孢子菌重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还提供了一种上述卡氏肺孢子菌重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：肺孢子菌动物模型的建立及DNA的提取，引物设计及PCR扩增，目的基因片段的纯化，目的基因片段与克隆载体的连接、转化、鉴定，目的基因片段与表达载体的连接、转化、鉴定，目的蛋白的诱导表达，目的蛋白的SDS‑PAGE鉴定，目的蛋白的纯化。同时，本发明还提供了三种上述卡氏肺孢子菌重组蛋白的应用。本发明的优点在于：本发明卡氏肺孢子菌重组蛋白可用于肺孢子菌感染的早期检测，用于制备预防疫苗，或者，作为药物用于减轻肺孢子菌感染带来的临床症状。

说明书

技术领域

本发明涉及医疗技术领域，尤其涉及一种卡氏肺孢子菌重组蛋白及其制备方法与应用。

背景技术

卡式肺孢子菌是一种感染人和多种哺乳动物的机会感染性真菌，它所引起的感染主要见于获得性免疫缺陷(HIV)、长期使用肾上腺皮质激素、细胞毒性药物、接受放化疗的恶性肿瘤、白血病、器官移植等患者。近年来，随着艾滋病患者数量日益增加，肺孢子菌感染者的数量也在不断增长。故对卡式肺孢子菌的检测、治疗、预防技术迫在眉睫。

由于肺孢子菌感染的临床症状不典型，传统的早期诊断方式有：(1)病原微生物学检验：经六胺银染色或者姬姆萨染色，检出包囊或滋养体即为阳性；该方法对于有创的取材方式会增加病人痛苦，且取材相对困难；且对于无创方式的咯痰获得的痰标本其各种染色方法敏感性均较低，阳性率在15％-92％之间，且不同实验室之间差别较大；另外，染色镜检耗时较长，通常半天才能染出2-4张切片；(2)聚合酶链式反应(PCR)、巢氏PCR等基因学检验：该技术需要培养专业的操作人员，同时对于患者来说检验的费用相对较昂贵。

目前，国内外对卡氏肺孢子菌的治疗与预防主要采用的是以下几种药物：复方磺胺甲恶唑、氨苯砜、戊脘脒等。然而，上述药物都存在很大临床毒副作用，且与之有关的临床耐药报道也在不断增加。

据此，目前急需探索和研究出一种能够用于早期检测，有效预防或者减轻临床症状的卡式肺孢子菌重组蛋白，这对于提高临床患者的生存率有着不可忽视的重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种卡氏肺孢子菌重组蛋白及其制备方法与应用，该重组蛋白可用于肺孢子菌感染的早期检测，用于制备预防疫苗，或者，作为药物用于减轻肺孢子菌感染带来的临床症状。

本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

一种卡氏肺孢子菌重组蛋白，所述卡氏肺孢子菌重组蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。

作为本发明的优选方式之一，编码所述卡氏肺孢子菌重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

一种上述卡氏肺孢子菌重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：

S1、肺孢子菌动物模型的建立及DNA的提取；

S2、引物设计及PCR扩增；

S3、目的基因片段的纯化；

S4、目的基因片段与克隆载体的连接、转化、鉴定；

S5、目的基因片段与表达载体的连接、转化、鉴定；

S6、目的蛋白的诱导表达；

S7、目的蛋白的SDS-PAGE鉴定；

S8、目的蛋白的纯化。

作为本发明的优选方式之一，具体如下：

S1、肺孢子菌动物模型的建立及DNA的提取

(1)动物模型的建立：

取雌鼠若干只，分A、B两笼饲养；其中，A笼小鼠：于小鼠腹股沟皮下注射地塞米松磷酸钠注射液，0.5mg每只，每三天注射一次，共给药8周；B笼小鼠：于腹小鼠股沟皮下注射磷酸盐缓冲液溶液作为对照；

实验过程中观察并记录两组小鼠的毛发色泽、呼吸、活动、摄食情况，并于每周测体重一次；

(2)取材：

于无菌超净台中解剖小鼠，并找到暴露的气管和肺叶；抽取肺泡灌洗液，并离心处理；

(3)GMS染色：

将上述肺泡灌洗液离心后获得的沉渣做成涂片，并进行六胺银染色处理；

(4)肺组织DNA的提取：

选择六胺银染色阳性的小鼠肺标本，使用动物基因组DNA抽提试剂盒提取PCP小鼠肺组织中的DNA；

S2、引物设计及PCR扩增

(1)设计目的基因片段A12

(2)PCR反应体系如下：5μL 10×PCR buffer，4μL 5mM dNTP预混液，2.5μL DNA模板，1.5μL10μM上游引物，1.5μL10μM下游引物、0.5μL Taq酶，35μL ddH

(3)PCR扩增条件为：

阶段一：95℃预变性，10min；1个循环；

阶段二：94℃变性，30sec；55℃退火30sec；72℃延伸30sec；30个循环；

阶段三：72℃延伸，10min；1个循环；

阶段四：4℃保温；

(4)对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；

S3、目的基因片段A12

采用DNA胶纯化回收试剂盒对PCR扩增成功的凝胶DNA进行纯化回收；

S4、目的基因片段A12

将目的基因片段A12

S5、目的基因片段A12

将目的基因片段A12

S6、目的蛋白His-A12

将上述鉴定为含有目的基因片段A12

S7、目的蛋白His-A12

对上述步骤获得的目的蛋白His-A12

S8、目的蛋白His-A12

采用镍柱对SDS-PAGE鉴定成功的目的蛋白His-A12

作为本发明的优选方式之一，所述步骤S8中，使用美国Novagen的Ni-NTA HisBind Resin Kit的蛋白纯化试剂盒进行目的蛋白His-A12

作为本发明的优选方式之一，所述步骤S8中，基于所述Ni-NTA His Bind ResinKit的蛋白纯化试剂盒的蛋白纯化方法为：

(1)镍柱的准备：

将3mL镍柱材料加入到试剂盒提供的空柱子中，待水柱中的水层滴完后，加入纯水压柱子使上端平整；

(2)镍柱纯化蛋白：

加8mL 8×Charge Buffer到柱子，使Ni

接着，加入8mL 8×Wash Buffer来洗脱杂蛋白；待8×Wash Buffer滴完后，加入4mL 4×Elute Buffer于纯化柱中，洗下目的蛋白，并收集流出液；

(3)收集目的蛋白后，加入4mL 4×Strip Buffer清洗纯化柱；待液体流干净，加2mL纯水，并用封口膜封住纯化柱口，垂直置柱子于4°冰箱中保存。

一种上述卡氏肺孢子菌重组蛋白在制备卡式肺孢子菌感染检测试剂盒中的应用。

一种上述卡氏肺孢子菌重组蛋白在制备卡式肺孢子菌疫苗中的应用。

一种上述卡氏肺孢子菌重组蛋白在制备治疗/预防卡式肺孢子菌药物中的应用。

本发明相比现有技术的优点在于：

(1)本发明卡氏肺孢子菌重组蛋白His-A12

(2)目前国内外尚无对于卡式肺孢子菌重组蛋白His-A12

(3)本发明建立在体内试验的基础上，于动物身上首次获得His-A12

(4)His-A12

附图说明

图1是实施例3中免疫42天后三组小鼠血清IgG效价的比较图；

图2是实施例3中不同时间段免疫His-A12

图3是实施例3中A、B、C三组CD8+T细胞中IFN-γ的表达量柱状展示图；

图4是实施例3中A、B、C三组CD8+T细胞中IFN-γ的表达量的流式图；

图5是实施例3中A、B、C三组CD4

图6是实施例3中A、B、C三组CD4

图7是实施例3中A、B、C三组小鼠肺组织中细胞因子的表达结果图；

图8是实施例3中A、B、C三组小鼠血清中细胞因子的表达结果图；

图9是实施例3中三组小鼠肺IFN-γ、IL-12p40、IL17的逆转录水平反映图；

图10是实施例3中A、B、C三组小鼠肺HE染色结果图(200×)；

图11是实施例3中A、B、C三组小鼠肺GMS染色结果图(400×)。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本实施例的一种卡氏肺孢子菌重组蛋白His-A12

实施例2

本实施例的一种实施例1中卡氏肺孢子菌重组蛋白His-A12

一、肺孢子菌动物模型的建立及DNA的提取

(1)动物模型的建立：

取清洁级昆明雌鼠30只，于敞开氏笼中普通饲养1周，使其适应环境后，分A、B两笼饲养。其中，A笼小鼠20只，于小鼠腹股沟皮下注射地塞米松磷酸钠注射液，0.5mg每只，每三天注射一次，共给药8周，期间定期更换饮用水(含1g/L四环素的冷开水，以预防细菌感染)和垫料，并正常喂养颗粒饲料；B笼小鼠共10只，于腹股沟皮下注射磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline，PBS)溶液作为对照。

实验过程中定期观察并记录两组小鼠的毛发色泽、呼吸、活动、摄食情况等，并于每周测体重一次。

(2)取材：

于无菌超净台中解剖小鼠；

固定小鼠，使其腹部朝上，并用酒精消毒即将解剖的部位；用无菌手术剪剪开胸腔，同时向上剪开颈部皮肤，找到暴露的气管和肺叶；用1mL注射器吸取0.3mL PBS，将针头由气管上端刺入，用PBS冲洗，如此反复5遍后抽取得到的1.5mL肺泡灌洗液；4℃离心，1500rpm/10min，取离心后沉渣做涂片。

(3)GMS染色：

1)将上述肺泡灌洗液获得的沉渣做成涂片，用甲醇固定3分钟后，用流水冲洗并晾干备用；

2)过碘酸溶液处理10min(溶液用后弃去)；

3)蒸馏水洗3次，每次5min；

4)65℃六氨银工作染1.5h；

5)蒸馏水洗3次，每次5min；

6)氯化金溶液调色1-2min；

7)蒸馏水洗3次，每次5min；

8)硫代硫酸钠溶液处理1min；

9)蒸馏水洗3次，每次5min；

10)核固红染色液染色10min；

11)蒸馏水洗3次，每次5min；

12)脱水、透明、封固。

(4)肺组织DNA的提取：

选择GMS染色阳性的小鼠肺标本，使用由上海生工生物科技有限公司购买的动物基因组DNA抽提试剂盒提取PCP小鼠肺组织中的DNA。

二、引物设计及PCR扩增

(1)使用premier primer 5.0设计目的基因片段A12

(2)PCR反应体系见表1，合成的引物根据说明书要求稀释至0.01mol/L。并且，PCR的全部加样过程均在冰上操作完成。

表1 PCR反应体系

(3)PCR扩增条件见表2。

表2 PCR扩增条件

(4)配1％的琼脂糖凝胶，将PCR产物(含loading buffer)和DNA Marker加入加样孔中，设置电压为118V，电泳30min后取出凝胶，置于凝胶成像系统中成像并拍取照片。

三、目的基因片段A12

根据购买的大连宝生物公司的DNA胶纯化回收纯化试剂盒提供的试验步骤进行操作。

四、目的基因片段A12

(1)将目的基因片段A12

表3连接反应体系

上述所有加样过程均在冰上操作完成。

(2)转化：

1)从-80℃冰箱中取出保存的DH5α大肠杆菌感受肽100μL，于冰上解冻；

2)吸取上述连接产物9μL轻轻混于100μLDH5α大肠杆菌感受肽中，置于冰上20min；

3)将上述产物置于42℃的水浴锅中，热休克90sec，注意此步骤要严格控制在90s；

4)热休克的产物迅速被转移到冰上2-3min；

5)吸取LB液体培养基900μL加入热休克产物中，轻轻吹打混匀后置于37℃摇床中孵育45min；

6)将上述孵育的产物离心，3000rpm/2min后，弃去200μL上清后，其余液体轻轻混匀；

7)将40μL2％的X-gal以及7μL20％的IPTG用无菌玻璃涂布器均匀涂布于LB固体培养基上，置LB固体培养基于37℃恒温箱中孵育使其表面的液体均匀吸收，其中LB固体培养基含有100mg/mL的氨苄青霉素；

8)将6)步骤中的转化产物用无菌接种环在上述LB固体培养基上密集划线。正面向上将LB平板放在室温条件下20min，待液体完全吸收后转移至37℃恒温培养箱中倒置平板，培养12-16小时。

(3)鉴定：

1)在无菌操作台上挑取上述转化步骤中LB平板上的单个菌落，置于4mLLB液体培养基中混匀并置于37℃摇床中孵育12-14小时

2)按照Axygen公司的质粒小抽提取试剂盒中提供的说明要求小量抽提质粒；

3)双酶切鉴定

EcoRI、SalI双酶切上述重组质粒，酶切体系如表4。

表4酶切体

上述所有加样步骤均在冰上完成。加样完成以后置混合物于37℃水浴中孵育2小时后开始2％的凝胶电泳，凝胶电泳条件同上。

五、目的基因片段A12

(1)提取表达载体pET28a的质粒及双酶切：

1)表达载体pET28a的质粒提：从-80℃冰箱中取出pET28a菌种，按照菌种：培养液等于1:100的比例加入到无菌LB液体培养基中摇菌，同时按照菌种：卡那霉素等于1:1000的比例加入抗生素，37℃摇床上，过夜摇菌12-16小时。质粒提取步骤按照Axygen公司的质粒小抽提取试剂盒中提供的说明要求小量抽提pET28a质粒。

2)双酶切片段的回收：将上述表达A12

(2)连接：

连接反应条件如表5。

表5连接反应条件

上述所有加样过程均在冰上操作完成。

(3)转化：

将上述表达载体转化至DH5α大肠杆菌感受肽中，转化步骤同前所述。

(4)鉴定：

包括双酶切鉴定和测序鉴定，步骤同前所述。

六、目的蛋白His-A12

(1)将上述鉴定为含有目的基因片段的菌种，用连续三区划线的方法接种到含有卡那霉素(100mg/mL)的LB固体培养基中，置于37℃的温箱中过夜培养。

(2)挑取平板上的单克隆菌落，接种到液体5mL LB液体培养基中(含5μL卡那霉素)，培养条件为37℃，200rpm震荡14小时。

(3)从上述过夜培养的菌液中每管都吸取2mL加入到相应的200mL的LB液体培养基中，同时每管中加入卡那霉素20μL，置于37℃摇床中，摇床转数为200rpm，培养3-4个小时。

(4)分别吸取上述3-4个小时培养的菌液，用分光光度计测量其OD

(5)IPTG刺激4-5小时后，分别将每瓶菌液转移到离心管，4℃下离心，4200rpm/10min，弃上清，每管沉淀用预冷的10mLPBS重悬。

(6)设置超声破碎条件为：超声破碎3s，间歇3s，一个循环设定为六分钟，共设定5个循环；超声破碎细胞的过程于冰上完成，以防止高温破坏蛋白成分。

(7)将上述超声破碎后的产物分装在2mL EP管中4℃，12000rpm/15min离心，目的蛋白His-A12

七、目的蛋白His-A12

(1)分别吸取持续培养过程中分别留取的加入IPTG后第0、1、2、3、4、5、6小时的菌液各40μL于1.5mL EP管中，分别标注为样品A、B、C、D、E、F，再分别于每个EP管中加入按照1:5的比例加入10μL蛋白上样缓冲液，充分混匀后，用水浴锅煮沸15min。

(2)按照购买的SDS-PAGE配胶试剂盒要求先配制浓度为15％的分离胶(下层胶)，再配制浓度为5％的浓缩胶(上层胶)，并插入梳子，制备出相应规格的加样孔。

(3)按照上述试剂方法配制出1×电泳缓冲液，倒入到电泳槽的内外槽中，按照顺序用加样器小心加入待测样品和蛋白Marker，后将内槽放置于外槽中，并将内外槽均加满电泳缓冲液，正确盖上带有正负极的电泳槽盖。

(4)设置电泳条件为：在55V电压下将浓缩胶和分离胶分开，约需要30min，改变电压为115V，60min后样本在分离胶中被分离出，关闭电源，取下玻璃板，切除长层浓缩胶，置于预先配制好的考马斯亮蓝R-250中，并置于脱色摇床上50rpm染色30min。

(5)染色完成后，将带有目的条带的胶置于预先配制好的脱色液中，并于脱色摇床上100rpm脱色，每15min跟换一次脱色液，连续脱色3次后，胶面无色或轻微蓝色即表明脱色完成，将胶置于凝胶成像仪中拍照记录。

八、目的蛋白His-A12

使用美国Novagen Ni-NTA His Bind Resin Kit的蛋白纯化试剂盒，按照产品说明书的操作步骤摸索出最佳纯化条件如表6。

表6最佳纯化条件

步骤：

(1)配柱子：将3mL His.Bing.Resin加入到试剂盒提供的空柱子中，并将柱子置于广口瓶瓶口上，用瓶身接住由柱子里流出来的液体，直到水柱中的水层滴完后加纯水压柱子使上端平整。

(2)过柱子：加8mL Charge Buffer(×8)到柱子直到液体滴完，再加4mL BindingBuffer(×8)滴完，加上述超声破碎后的菌液10mL，待菌液完全滴完以后，加入剩余的20mLBinding Buffer(×8)，直到液体滴完。

(3)加入8mL的Wash Buffer(×8)洗脱杂蛋白。

(4)将纯化柱置于1.5mL EP管上，并加入4mL Elute Buffer(×4)于纯化柱中，每收集1mL更换一个1.5mL EP管，收集洗脱的目的蛋白。

(5)加入4mL Strip(×4)，清晰纯化柱，待液体流干净以后加2mL的纯水，并用封口膜封住纯化柱口，垂直置柱子于4°冰箱中保存。每根纯化柱可反复利用多次。

实施例3

本实施例用以说明上述实施例中重组蛋白His-A12

一、免疫程序

(1)动物选择及分组：45只昆明雌鼠被随机分成A、B、C三笼，每笼15只。三笼小鼠全部暴露于外界环境中饲养，饲养过程中不限量饮用高压灭菌水，且期间定期更换小鼠垫料和食料。

(2)免疫方案：His-A12

剂量：150μg/只；

A组：免疫His-A12

B组：免疫PBS+佐剂；

C组空白对照。

第0天，免疫前分别断尾取三笼小鼠的血清，作为阴性对照。A组将乳化完全的His-A12

免疫抗原的第42天断尾取血，做效价检测。同时，A、B、C三组小鼠开始接受地塞米松注射液腹股沟皮下的注射，每只小鼠的注射剂量为0.5mg，同时为了防止细菌感染，更换小鼠的饮用水为含1.0g/l的四环素灭菌水。每隔三天注射地塞米松溶液一次，连续8周。期间定期观察每组小鼠的食量和饮用水量，色泽以及活动度。

本研究用重组蛋白疫苗His-A12

二、免疫效果：

1、ELISA法检测小鼠对重组蛋白的免疫效果

(1)免疫42天后三组小鼠IgG血清效价的比较：

最后一次免疫注射两周后，如图1所示，各组小鼠免疫效价水平之间的比较(A组与B、C两组相比有明显差异，P＜0.05，B、C两组之间无统计学差异)。

(2)A组小鼠不同时间段免疫His-A12

如图2所示，随着免疫次数的增加，免疫His-A12

2、流式分析免疫后小鼠的炎症因子的变化

A、B、C三组CD8

结果分析：由图3-图6可知，A组CD4+T细胞中IFN-γ的表达量和CD8+T细胞中IFN-γ的表达量均高于B组和C组的表达量(P＜0.05)，B组和C组之间的表达量无统计学差异。研究表明，IFN-γ主要由Th1细胞和NK细胞分泌，能明显增强MHC-1和MHC-Ⅱ的表达，从而促进T细胞和B细胞分化，增强NK细胞活性，激活单核巨噬细胞并通过抗原提呈作用提高免疫功能。

3、ELISA分析免疫后小鼠的炎症因子的变化

A、B、C三组小鼠肺组织中细胞因子的表达结果见图7，A、B、C三组小鼠血清中细胞因子的表达结果见图8。

结果分析：由图7、图8可知，A组小鼠无论肺中还是血清中IFN-γ、IL12/P40、IL-17三种炎症因子都高于B、C两组(P＜0.05)，B、C两组小鼠的三种炎症因子变化无差异。证明免疫重组蛋白组的小鼠体内发生了一系列炎症反应，有效激活并促进Th1细胞增殖，从而介导细胞免疫反应。

4、QRT分析免疫后小鼠的炎症因子的变化

QRT分析三组小鼠肺IFN-γ、IL-12p40、IL17的逆转录水平，结果见图9。

结果分析：QRT结果显示，免疫后的小鼠，A组小鼠体内IFN-γ、IL-12p40、IL17细胞因子所逆转录的mRNA水平明显增高(P＜0.05)，此结果和ELISA结果保持一致，验证了免疫了重组蛋白疫苗组小鼠体内发生了一系列炎症反应，有益于肺孢子菌的清除。

5、HE染色和六胺银染色结果

(1)HE染色结果显示：如图10所示，A组小鼠的肺泡结构较清晰，肺泡壁无明显增厚，肺泡腔内有中量中性粒细胞和淋巴细胞等炎症细胞浸润。B组小鼠肺泡腔内充满大量的中性粒细胞、巨噬细胞；局部伴有大面积出血；肺泡间隔增宽。C组小鼠肺泡壁增粗；部分肺泡萎缩，部分肺泡代偿性融合成大肺泡；肺泡壁和部分肺泡腔内可见中性粒细胞以及巨噬细胞等炎症细胞浸润，肺泡间隔增宽。

(2)三组小鼠感染后GMS染色后及肺印片包囊均数比较情况：如图11所示，A组小鼠的肺印片在400×显微镜下观察到少量肺孢子菌，而B、C两组的肺印片在400×显微镜下中能看到孢子菌聚集成团状，数量明显多于A组。

同时，肺印片包囊情况如表7所示，A组小鼠肺印片每个视野包囊均数小于B、C组(P＜0.5)，而B、C两组之间无明显差异。

表7 A、B、C三组小鼠肺印片包囊均数比较

综上所述，本发明卡氏肺孢子菌重组蛋白His-A12

此外，经初步验证，用该重组蛋白His-A12

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽医科大学第四附属医院

<120> 一种卡氏肺孢子菌重组蛋白及其制备方法与应用

<130> 2021

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg

20 25 30

Gly Ser Glu Phe Thr Asn Ile Ser Glu Pro Ala Leu Pro Asp Lys Asp

35 40 45

Pro Gln Pro Thr Ser Ser Pro Gln Pro Lys Pro Arg Pro Arg Pro Arg

50 55 60

Pro Gln Pro Gln Pro His Pro His Pro Lys Pro Gln Pro Gln Pro Thr

65 70 75 80

Pro Glu Pro Gln Pro Gln Pro Ala Pro Glu Pro Arg Pro Gln Pro Thr

85 90 95

Ser Lys Pro Arg Pro Gln Pro Thr Ser Lys Pro Arg Pro Gln Pro Thr

100 105 110

Pro Glu Pro Arg Pro Leu Pro Val Pro Leu Glu His His His His His

115 120 125

His

<210> 2

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccgaattcac caatatatcc 120

gaaccagcac tgcctgataa ggatcctcaa cctacatctt cacctcagcc aaaacctcgg 180

ccaagacctc gacctcaacc tcaacctcat ccacatccaa aacctcagcc tcagccgacg 240

ccagaacctc agcctcagcc ggcgccagaa cctcgacctc agccgacgtc aaaacctcga 300

cctcagccaa cgtcaaaacc tcgacctcag ccgacgccag aacctcgacc tctgccggtg 360

ccactcgagc accaccacca ccaccactga 390

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

accaatatat ccgaaccagc act 23

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caccggcaga ggtcgag 17