孕期边缘型维生素A缺乏对仔鼠肺发育的影响及机制研究

摘要

目的：了解胚胎期开始的边缘型维生素A缺乏（MVAD）对仔鼠生后不同时间点肺发育、肺泡结构和肺泡上皮的影响，以及在生后早期给予维生素A干预（VAI）对肺损伤的恢复程度。 方法：清洁级健康雌性Wistar大鼠18只随机分为3组，饲以相应饲料，3周后与健康雄性Wistar大鼠交配，1：2雌雄合笼：（1）正常对照组（Control）（6只），给予VA充足饲料（含VA6500 IU/kg），随机抽取39只仔鼠用于本实验，仔鼠饲料与母鼠相同：（2）MVAD组母鼠（6只），给予MVAD饲料（含VA400 IU/kg），随机抽取39只仔鼠用于本实验，仔鼠饲料与母鼠相同；（3）生后干预组（VAI）（6只），给予MVAD饲料至分娩，然后改饲VA充足饲料，随机抽取39只初生仔鼠用于本实验，仔鼠于生后l天开始给予5倍RNI VA灌胃，每天一次连续7天，断乳后换为正常饲料。各组仔鼠于出生时、生后2周、8周龄处死。记录仔鼠体重和肺重，用高效液相色谱法（HPLC）检测血清和肺组织VA浓度，形态定量学方法分析肺泡隔厚度，肺泡数量和肺泡表面积的改变，同时用半定量RT-PCR方法检测肺泡上皮特有的表面活性物质相关蛋白SP-B，SP-CmRNA水平的变化。 结果：①血清VA浓度：MVAD母鼠交配时血清VA浓度明显低于对照组，孕鼠和仔鼠未出现明显VA缺乏的临床表现。仔鼠生后各时间点血清VA浓度均低于Control组（P<0.05），而肺组织VA浓度出生时和正常组无明显区别，但2周和8周时低于正常组（P<0.05）。VAI组生后2w血清VA浓度即恢复至正常，而肺组织VA浓度一直维持在稳定水平，和正常组无明显区别。②体重和肺重：MVAD组出生时、生后2周体重均明显低于正常对照组（P<0.05），8周时3组体重差异无统计学意义，但正常组和VAI组均略高于MVAD组。MVAD组仔鼠各时间点肺重均低于正常对照组（P<0.05），VAI组8周时肺重恢复至正常水平。肺重/体重分数显示各时间点三组间无差异，2周和8周时MVAD组和VAI组略高于正常对照组。③肺组织形态学定量分析：MVAD组仔鼠在各时间点肺泡隔均显著厚于正常对照组（P<0.05），2周和8周时肺泡表面积和肺泡数量均少于正常对照组（P<0.05）。VAI组8周时除肺泡表面积仍少于正常对照组其余无明显区别。④肺表面活性物质相关蛋白：正常对照组肺组织表面活性物质相关蛋白SP-B，SP-CmRNA水平生后1天、2周和8周无明显区别，但MVAD和VAI组各时间点均高于Control组（P<0.05）。 结论：①从胚胎期开始的MVAD会影响仔鼠肺发育过程，表现为肺重的减轻，肺泡隔增厚，肺泡数量和肺泡表面积的减少，可持续至成年期。②生后早期进行VA干预可以恢复大部分肺发育和结构的改变，但至成年期时肺泡表面积仍不能完全恢复至正常。③MVAD会导致肺泡上皮特有的表面活性物质相关蛋白SP-B，SP-C mRNA水平上调，而VAI组这种改变也不能恢复至正常水平。 目的：探讨胚胎期开始的边缘型维生素A缺乏（MVAD）对仔鼠生后不同时间点肺间质细胞外基质弹性纤维、胶原的结构和量的影响，以及在生后早期给予维生素A干预（VAI）的恢复程度。 方法：清洁级健康雌性Wistar大鼠18只随机分为3组，饲以相应饲料，同第一部分。各组仔鼠于出生时、生后2周、8周龄处死。用醛品红染色法检测肺组织弹力纤维的分布，结构和量的改变，用Masson三色染色法观察肺组织胶原纤维的分布，结构和量的改变，用碱水解法测定肺组织羟脯氨酸含量。 结果：①弹性纤维被染成紫红色，沉积在肺泡间隔，细支气管。生后1天MVAD组未发现弹性纤维的减少，但在2周和8周时明显低于正常对照组（P<0.05），弹性纤维结构粗糙不光滑。生后早期VA干预可以使弹力纤维恢复至正常组水平，结构也变得规则有序。②胶原被染成蓝灰色，沉积在肺泡间隔，细支气管及血管壁，排列整齐。MVAD组肺泡间隔、细支气管、小血管胶原纤维明显增多，互相交织呈网状，着色较深，外表粗糙。MVAD组胶原蛋白的沉积在生后1天低于正常对照组，但在生后2周（P<0.05）及8周（P<0.05）时高于正常对照组，但是呈现的是无规律的形态。生后早期VA干预在2周及8周时能降低胶原的沉积，且形态规则。③随着年龄增长各组仔鼠肺组织羟脯氨酸含量逐渐增加，MVAD组出生时羟脯氨酸略低于Control组，但差异无统计学意义，2周和8周时明显增加（P<0.05）。VAI组出生时略低于Control组，生后2周、8周和Control组相比无明显差异。 结论：①从胚胎期开始的MVAD会影响仔鼠肺基质弹力纤维的结构和量，主要表现为生后弹力纤维的减少和结构的紊乱。②从胚胎期开始的MVAD会影响仔鼠肺基质胶原的分布和沉积，表现为生后2周和8周胶原纤维的过度沉积和结构紊乱，而羟脯氨酸也显示胶原蛋白的增多。③而生后早期给予VA干预可以使弹力纤维和胶原结构和量恢复至正常水平。 目的：进一步探讨胚胎期开始的MVAD对仔鼠肺发育的影响是否通过调节其体内活性代谢物质RA的核受体RARs发挥作用。 方法：清洁级健康雌性Wistar大鼠18只随机分为3组，饲以相应饲料，同第一部分。各组仔鼠于出生时、生后2周、8周龄处死。用半定量RT-PCR方法检测肺组织RARα、β、γ的mRNA水平，用免疫荧光激光共聚焦方法观察RARs在肺组织中的空间分布和表达量的改变，进一步用western-blotting方法了解RARs蛋白水平的变化及亚细胞定位。 结果：①生后正常肺组织中RARa mRNA表达最强，而RARγ表达最弱。RARa和RARβ均在出生时表达最强，随着年龄的增长至成年期表达减弱，RARγ无明显变化。MVAD对于RARa和RARβ的mRNA水平有明显影响表现为转录水平的增强（P<0.05）。②免疫荧光激光共聚焦显示荧光强度变化与mRNA表达基本相符。生后RARs的空间定位主要为肺泡间隔的一些散在的细胞中，在支气管和血管仅有少量的表达。而MVAD对于空间定位无明显影响。③western-blotting的结果显示MVAD组RARa和RARβ蛋白水平在2周和8周是明显增加。提示VA对于RARs的转录水平和蛋白水平均有明显的影响。而RARs蛋白的表达存在胞核向胞浆的转移过程，表现为在8周肺泡发育结束时，RARa和RARβ也从胞核中转移至胞浆。而RARs蛋白的亚细胞定位也受到VA营养状态的影响，MVAD时胞核表达明显增强，至8周时胞核内仍有表达。但生后早期的干预RARs mRNA、蛋白水平和亚细胞定位不能恢复至正常。 结论：①肺表达RARs受体的种类和量具有一定的年龄阶段性，而这种特异性伴随肺泡发育的全过程。不同年龄阶段RARs的亚细胞定位存在从胞核至胞浆的转移过程，而这一过程与生后肺泡发育的过程有明显的相关性，这种转移可能反应了蛋白转化和成熟的改变，是RA功能多样性的分子基础。②RARs的量和定位明显受到机体VA营养状态的影响。MVAD可以导致RARs表达的增加，且胞核表达增加可能为机体的代偿性的反应，而生后早期VA干预也不能使RARs的表达和定位完全恢复至正常水平，进一步提示孕期VA营养对于肺有序正常发育有重要的作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英汉缩略语名词对照

声明

前言

第一部分 孕期边缘型维生素A缺乏影响仔鼠肺结构和肺泡上皮发育的研究

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第二部分 孕期边缘型维生素A缺乏影响仔鼠肺基质的研究

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第三部分 孕期边缘型维生素A缺乏影响仔鼠肺发育机制的研究

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

全文总结

附 图

文献综述一:维生素A在肺泡发育和重建中的作用

文献综述二:视黄酸受体在肺发育过程中的阶段性表达和作用

致 谢

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