产朊假丝酵母尿酸酶的纯化、特性研究及其基因扩增

摘要

尿酸是人体嘌呤碱基分解代谢终产物，经肾脏排泄。体内尿酸生成超过肾脏排泄时血清尿酸会显著升高，造成高尿酸血症。高尿酸血症与痛风、心血管疾病、肿瘤裂解综合征及肾脏疾病的引发或加剧密切相关。因此，需要开发有效的药物来治疗高尿酸血症。当前，尿酸酶被认为是治疗高尿酸血症相关疾病的理想药物。本项目对产朊假丝酵母菌及其尿酸酶进行了如下研究： 1.产朊假丝酵母菌的培养及其尿酸酶的制备、纯化产朊假丝酵母菌(C.GM.C.C.2.1008)经一定浓度尿酸诱导培养后，离心收集菌体，超声粉碎，离心，取上清即粗酶液，经硫酸铵分级沉淀后，尿酸酶比活性＞0.32 U/mg蛋白。在DE.AE-cellulose 52柱上，pH 8.0时此尿酸酶不被吸附，两次层析后所得比活性达7.1 U/mg蛋白。 2.尿酸酶的特性研究Sephadex G.200凝胶过滤层析推测此尿酸酶的分子量为134.0kD。SDS.PAGE分析DEAE-cellulose 52纤维素柱层析两次所得最高比活性尿酸酶制剂(＞7.0 U/mg蛋白)，发现此酶只含一种约33.0 kD的多肽，MAILDI-TOF-MS分析最高比活性样品没有检测到单一肽链，而丰度最高成分为67.7 kD，次高成分为131.4 kD。25+0.5℃时，此尿酸酶最适pH接近8.8，在pH 7.4时可保留50％以上活性，37℃时4 h内稳定，米氏常数为(32.8±3.1)μmol/L(n=lO)。抑制剂谱测定发现：除腺苷、鸟苷和肌苷对该尿酸酶无抑制作用外，氧嗪酸钾的抑制常数为(1.1±0.1)μmol/L(n=3)，黄嘌呤的抑制常数为(4.8±0.2) μmol/L(n=3)，鸟嘌呤的抑制常数为(37.9±4.2)μmol/L(n=3)，次黄嘌呤的抑制常数为(500.0±60.0)μmol/L(n=3)，腺嘌呤的抑制常数为(748.9±82.0)μmol/L(n=3)，别嘌呤醇的抑制常数为(927.6±95.0)μmol/L(n=3)。用蒸馏水透析后失活90％以上，且随后加NaCl处理后酶活性不能恢复。1.0mmol/L 碘乙酸30 min内可使该尿酸酶完全失活，1.0 mmol/L 的Cu2+和Fe3+ 对此酶有明显抑制作用。这些结果表明此尿酸酶需通过分子工程改造才能用作治疗高尿酸血症相关疾病的药物。 3.产朊假丝酵母菌尿酸酶基因的PCR扩增、测序利用试剂盒提取出产朊假丝酵母基因组DNA，设计特异引物，优化PCR.条件，最终扩增出大小与我们预计相符的DNA片段。对此片段进行胶回收纯化后送去测序，将正、反向测序结果比对拼接得到最后的序列。用BLAST 在NCBI数据库中搜索进行序列比对，发现该序列大部分与Pichia guilliermondii ATCC 6260 hypothetical protein(PGUG_04255)partial mRNA相似性最高。由此可初步断定该序列为产朊假丝酵母C.G.M.C.C.2.1008尿酸酶的基因序列，为后续工作奠定基础。

目录

论文说明：英汉缩略语名词对照

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摘要

前言

第一部分产朊假丝酵母菌的培养及其尿酸酶的制备、纯化

1材料与方法

2结果

3讨论

4参考文献

第二部分产朊假丝酵母尿酸酶的特性研究

1材料与方法

2结果

3讨论

4参考文献

第三部分产朊假丝酵母尿酸酶基因的扩增、测序

1材料与方法

2结果

3讨论

4参考文献

全文总结

附图

致谢

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