产朊假丝酵母尿酸酶热失活机制的研究

摘要

尿酸酶是治疗高尿酸血症的药用酶和测定血清尿酸的工具酶，需提高其活性和热稳定性。天然产朊假丝酵母菌(C.G.M.C.C.2.1008)尿酸酶有优良热稳定性；本文分析其热失活过程解释其机制。本研究分为三个部分：
　　⑴产朊假丝酵母尿酸酶热失活曲线的表征。产朊假丝酵母尿菌株(C.G.M.C.C.2.1008)扩大培养后，经尿酸诱导，表达尿酸酶。离心收集菌体，超声裂解，离心收集上清粗酶液，经DEAE-cellulose52纤维素柱纯化，采用负吸附的方法，收集穿透液，经PEG-20000浓缩，透析过夜。酶粗品经上述步骤纯化2次，得到尿酸酶纯品，SDS-PAGE表征其纯度，比活为10.0 kU g-1。样品经中国科学院上海生命科学研究院蛋白质组学研究分析中心分析证明：1）蛋白质样品纯度为93.26％。2）肽链分子质量17.35 kD。3）MALDI–TOF/TOF分析证实其氨基酸序列类似于FAD依赖性吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶(gi|154253900)。4）N端封闭而未能有效进行Edman降解测定其N端氨基酸序列。酶蛋白保存体系，含抗生素，对氨基苯甲脒，EDTA，PMSF，小分子抑制剂类配体及浓缩蛋白样品，在37℃不同 pH条件下保存。间隔一定时间取样测定酶活性以记录其衰减过程。发现该尿酸酶的热失活过程分为显著的两个阶段：前一阶段其活性保持在一个平台期（活性的下降不超过初始活性的10%），而后一阶段尿酸酶的活性呈类似指数衰减至30%以下，平台期后活性衰减一半的时间段称为半衰期，这种特殊的热失活现象称为平台期效应。在pH=7.4条件下，平台期为4天，加入小分子抑制剂氧嗪酸钾，平台期增加至23天；在pH=9.2条件下，平台期为12天，加入氧嗪酸钾，平台期延长至24天。
　　⑵产朊假丝酵母尿酸酶热失活模型的建立与分析。公认尿酸酶活性结构形式为4个相同的单体聚合而成的四聚体。热失活后的该假丝酵母尿酸酶样品经SDS–PAGE及酸性PAGE分析，发现大量四聚体解聚为二聚体和单体，而可溶性总蛋白量并未明显减少，说明尿酸酶热失活的原因可能是由于寡聚体的解聚而非蛋白质的降解。在含配体的保存体系中，四聚体减少的速度降低。在尿酸酶热失活过程中，同四聚体与同二聚体间有多对非共价相互作用，在同四聚体解聚至两个非变性同二聚体之前，存在多个构象中间体。设最弱非共价相互作用的断裂与再形成为基元反应。假定在热失活过程中，多个更强非共价相互作用的动力学及热力学的贡献都可用多个基元反应的累积贡献而代替。基于以上假设建立如下动力学模型：含有n个四聚体形态系列中间体定义为Tm(其下标m表示所含维持四聚体结构的基元反应数量)；Tm相互之间的差异仅在基元反应数量；它们相互之间保持可逆动态平衡；仅含一个基元反应的四聚体状态中间体最终可逆性转化为非变性二聚体HD，而HD将进一步不可逆转化为变性的二聚体DD。将所涉及基元反应的两个方向及其它各转化速率常数设为参数，将四聚体总浓度归一化；通过迭代数值积分计算给定参数组合所对应的尿酸酶的热失活曲线，用于最小二乘拟合（LSF）实验测定的热失活曲线，获得所需参数组合。通过Matlab软件分析热失活曲线，发现参数之间有严重的协方差；其中基元反应断裂的速度常数(k1)最关键。为消除参数之间的协方差，将k1设定为常数再拟合热失活曲线且k1满足如下要求：(a)以0.0001为速度常数下限；优化k1使所有其它速度常数都大于0.001/min；(b)使m尽量小以降低计算量；（3）使得其他参数能够关联以便比较。据此拟合热失活曲线结果表明：无氧嗪酸钾诱导的条件下，在pH7.4时m=24，在pH9.2时m=64；在氧嗪酸钾诱导条件下，在pH7.4时m=80，在pH9.2时m=140。进一步分析各种条件下平台期长短及所得基元反应逆反应速度常数(k-1)、非变性二聚体再聚合成四聚体的速度常数 k-2及非变性二聚体变性速度常数 k2表明，此真菌尿酸酶活性指数下降之前的平台期由m决定，而非k_2与k_1或k2；氧嗪酸钾与此尿酸酶的结合可能导致其构象变化，大大增加同二聚体之间的相互作用而提高四聚体稳定性，并同时减少同二聚体的变性速度和再聚合成四聚体的速度。此尿酸酶热失活平台期长短和指数衰减部分的半衰期不是尿酸酶同四聚体解离的热力学，而是其解聚动力学决定的。
　　⑶热失活动力学模型的应用。以热失活动力学模型为基础，设计了苛求芽孢杆菌尿酸酶突变体，将291位E-R离子键破坏，成功表达纯化了突变体E291Q。与野生型尿酸酶热稳定相比，E291Q在不同pH条件下和氧嗪酸钾配体诱导条件下，热稳定性均有所减弱。E291Q在无配体诱导条件下，无平台期，加入配体氧嗪酸钾，观察到明显的平台期，热稳定性明显恢复，但仍未达到野生型的热稳定性，说明离子键的破坏对其热稳定性的降低有明显作用。电泳结果显示，E291Q系统中四聚体和二聚体均有存在，且二聚体条带中显示出催化活性，可能在染色过程中其同二聚体在底物诱导下，重新组配成四聚体。以前文建立的尿酸酶动力学模型分析E291Q的热失活过程，发现该模型能很好地拟合其热失活曲线。模型参数分析显示，结合了氧嗪酸钾分子后，尿酸酶同四聚体中间体数目明显增加，说明配体的结合使尿酸酶四聚体内部的相互作用力明显增加；动力学参数显示，E291Q在无氧嗪酸钾结合的条件下，同四聚体间转化的速率常数很高，同四聚体的稳定性差，而在结合了底物之后，大量的非变性同二聚体又迅速组配成同四聚体，解释了电泳图中二聚体条带存在的原因。小分子配体的结合增加了四聚体内部相互作用的基元反应数量，大大延长了四聚体解聚的动力学过程，延缓其热失活而出现平台期。同时推测，尿酸酶中离子键的破坏将涉及尿酸酶表面整体静电网络的破坏，这种破坏在一定程度上通过pH效应及配体诱导效应恢复，但无法达到最好的状态。尿酸酶热失活动力学模型能有效预测并解释尿酸酶热失活的常见过程与现象，证明模型设计成功和其理论价值。

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前言

第一部分 产朊假丝酵母尿酸酶热失活曲线的表征

1材料与方法

2实验方法

3 结果与讨论

4本部分小结

第二部分 产朊假丝酵母尿酸酶热失活模型的建立和分析

1材料与方法

2.结果与讨论

3.本部分小结.

第三部分 尿酸酶热失活动力学模型的应用

1．材料与方法

2．结果与讨论

3．本部分小结

全文总结

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文