沉默hTERT基因表达对不同p53状态卵巢癌细胞生长及凋亡的快速影响

摘要

端粒酶因可在细胞内通过其逆转录酶活性复制和延长染色体末端的端粒重复序列（TTAGGG）而广为人知。其可使细胞克服因每次有丝分裂而造成的端粒缩短，因此在细胞的永生化中扮演着重要的角色。人端粒酶活性的表达由端粒酶主要组成部分之一--端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）的转录水平所调控。由于hTERT仅在大部分恶性肿瘤组织中特异性表达，而正常组织中（造血干细胞，生殖细胞除外）一般无表达，故通过抑制hTERT表达从而抑制端粒酶活性可能成为肿瘤治疗的特异性靶点。靶向hTERT的基因治疗与目前认可的治疗方法相比，将具有更少的毒性副反应。 过去认为，单纯针对端粒酶的抑制剂由于端粒需要一定的时间才能缩短至可以诱发细胞衰老死亡的临界长度，故其治疗效果有一定的滞后性，且疗程的长短在很大程度上依赖于治疗起始时细胞端粒的长度以及细胞有丝分裂的周期长短。但与此不符的是，许多针对hTERT和端粒酶的研究都显示，一旦hTERT表达受抑，肿瘤细胞可以很快出现凋亡，且并不一定伴有端粒长度的明显改变。提示抑制端粒酶活性可能通过某种未知的机制，导致肿瘤细胞遵循另一条不依赖端粒长度损耗的“快速通道”而迅速走向死亡。由于抑制hTERT表达的抗肿瘤机制尚不明确，目前报道其在不同肿瘤细胞中的作用也各不相同，故有必要针对不同组织学类型的肿瘤进行具体的研究。 p53是在多条生长相关通路包括凋亡、细胞周期阻滞以及衰老中扮演关键角色的肿瘤抑制基因，已证实其可以通过抑制Sp1与hTERT启动子结合而下调hTERT的转录活性。但直到最近才有报道显示hTERT的过度表达或抑制也可以立即对p53的表达产生负性或正性的影响，且不伴有细胞端粒长度的改变，提示在hTERT与p53之间可能存在一定的反馈通路，hTERT可能通过某种端粒以外的效应作用于自身的细胞周期调节基因，而不需要依赖端粒长度的缩短。目前尚无研究显示由hTERT表达改变所引起的p53转录活性改变是否与导致细胞死亡的“快速通道”相关，但由于p53与凋亡的密切相关性，我们推测抑制hTERT表达所引起的细胞快速死亡可能与p53的表达改变有关。 研究目的：本研究的目的是检测hTERT基因表达沉默后能否引起多种卵巢癌细胞生长的快速抑制和死亡，并探讨这种现象与p53基因表达激活的相关性。我们旨在在含有不同p53状态的卵巢癌细胞中，探索抑制hTERT表达发挥效应的快速作用模式，并希望对此过程的更深刻理解能够为发现对hTERT抑制剂敏感或抵抗的原因提供新的线索，为卵巢癌的治疗提供新的思路。 研究方法：本研究构建了两个靶向hTERT的发夹状RNA干扰质粒pG1和pG2，和一个由与人类基因无同源性的随机序列组成的对照质粒pGCR，并将其在体外和体内分别转染入含不同p53状态的三株端粒酶阳性卵巢癌细胞中，包括含野生型p53的A2780细胞、含突变型p53的OVCAR3细胞和缺乏p53表达的SKOV3细胞。 在体外实验中，A2780，OVCAR3和SKOV3细胞分别进行了pG1，pG2质粒的转染，以pGCR质粒和未处理的细胞作为对照。hTERT的抑制效率分别通过实时荧光定量RT-PCR和免疫印迹进行了验证，转染后细胞的端粒酶活性则以TRAP法进行检测。采用CCK-8检测细胞的生长情况，流式细胞仪进行细胞周期分析。细胞凋亡情况则采用AnnexinⅤ-PE/7AAD双染和TUNEL法分别进行了检测，以免疫印迹检测p53和其下游基因p21的表达情况。 在动物实验中，将A2780和SKOV3细胞注射至裸鼠皮下以构建移植瘤模型。成瘤后随机分为3组，予以干扰质粒pG2、乱序质粒pGCR以及生理盐水分别瘤内注射，隔日一次共2周。每次注射前测量肿瘤大小，治疗完毕后完整剥离肿瘤称重并制成石蜡切片行HE染色进行形态学观察，采用TUNEL及电镜检测细胞凋亡情况，以免疫印迹法检测hTERT表达抑制情况，p53及p21的表达则采用免疫组化进行检测。 研究结果：1.酶切及测序结果显示重组质粒pG1、pG2和pGCR构建成功。实时荧光定量RT-PCR、免疫印迹和TRAP分析显示靶向hTERT的发夹状RNA干扰质粒能够有效地抑制卵巢癌细胞中hTERT mRNA和蛋白的表达并抑制端粒酶活性。 2.体外实验中，沉默hTERT基因表达能够引起三株卵巢癌细胞快速的生长抑制，细胞周期分析显示抑制hTERT表达主要通过将细胞周期阻滞在S期而导致细胞生长减慢。其中两株细胞株，A2780和OVCAR3，在hTERT表达受抑后均很快出现了明显的凋亡，同时伴随着p53和p21表达的增高。相反的是，沉默hTERT基因在缺乏p53基因表达的SKOV3细胞中并未导致明显的凋亡，其p21基因表达也较对照组降低。 3.成功构建A2780和SKOV3细胞裸鼠皮下移植瘤。与注射pGCR和生理盐水组相比，重组质粒pG2在体内能够显著减慢两种细胞移植瘤的生长，减小肿瘤体积并减轻肿瘤重量。在A2780细胞移植瘤中出现了大量的凋亡和坏死，同时p53和p21的表达也明显增强。但在SKOV3细胞移植瘤中仅观察到大片状的坏死，细胞凋亡不明显，p21的表达较对照组相比没有明显改变。未发现治疗后的裸鼠有明显的毒副反应。 结论：针对hTERT的发夹状RNA干扰质粒在体内外均能有效地和特异地沉默卵巢癌细胞hTERT基因的表达、降低端粒酶活性并迅速引起肿瘤细胞的生长抑制。但在含有不同p53状态的细胞系中，其引起细胞死亡的机制并不相同，抑制hTERT表达所立即引起的卵巢癌细胞凋亡与其引起抑癌基因p53及p21上调有关。我们再一次证实了在通过使端粒逐渐缩短而引起细胞衰老死亡的“经典途径”以外，抑制端粒酶活性还可以通过另一条并不依赖于细胞端粒长度改变的“快速通道”引起细胞的迅速死亡。这对以hTERT和端粒酶为靶点的抗肿瘤治疗具有重大意义。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英汉缩略语名词对照

声明

前言

第一部分 hTERT基因siRNA真核表达载体的构建及其在不同卵巢癌细胞中抑制效果的检测

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

参考文献

第二部分 RNAi抑制hTERT基因表达对不同p53状态卵巢癌细胞株生物学特性的影响

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

参考文献

第三部分 RNA干扰沉默hTERT基因在体内对人卵巢癌裸鼠移植瘤的治疗作用

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

参考文献

全文总结

附 图

文献综述 人端粒酶逆转录酶(hTERT)与卵巢癌

致谢

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