小鼠胎肝干细胞经化学试剂诱导向心肌细胞方向分化的研究

摘要

冠状动脉粥样硬化性心脏病，特别是急性心肌梗死，是严重危害人类健康的常见病，多发病。目前虽然能在发病4-6小时内通过及时溶栓或介入治疗以挽救濒临死亡的心肌组织，但由于绝大部分患者就诊时缺血心肌已经坏死。此时再灌注治疗只能防止梗死面积的扩大，而无法挽救已经坏死的心肌。如何更有效地治疗冠心病，成为医学研究的焦点。而新近的研究结果，为患者带来了希望。 传统观点认为，心肌细胞出生后即向终末分化，不能够复制，并且成年心肌组织中没有储存的心肌祖细胞，因此心肌受损后心肌细胞不能再生，被疤痕组织代替，最终导致心脏的收缩功能受损。 然而目前很多研究结果给我们带来观念上的更新：其一，心脏不是终末分化器官，心肌中有75％的细胞是单核细胞，25％是双核细胞，这一比例不受疾病、年龄、性别、心肌肥大及心肌缺血等影响。其二，急性心肌损伤促进心肌细胞代偿性增殖。 虽然有研究显示：急性心肌梗死后也有少量心肌细胞发生分裂增生。但分裂的细胞数量很少，修复心肌组织的能力有限。因此，细胞移植，这一旨在增加心肌细胞数目的方法可能是有效治疗心肌损伤的最佳选择。 目前研究多集中在胚胎干细胞、骨骼肌干细胞、骨髓间充质干细胞等各类干细胞的心肌移植，并屡有移植细胞在体内存活分化，修复梗死心肌，改善心脏功能的研究报道。然而要将上述研究最终用于临床，却面临诸多问题。 胚胎干细胞是来源于哺乳动物早期胚胎的内细胞团或桑椹胚的二倍体细胞，从植入子宫内膜前的囊胚中提取，在体外分离培养而建立的细胞系。其显著特征是可以在体外长期保持不分化状态下的增殖能力，并仍具备分化为三胚层细胞的稳定发育潜能，有“万能细胞”之称。近年有些国家已解除胚胎干细胞研究的禁令，为其扫除了社会和伦理方面的障碍。但获取受限和移植排斥反应是限制其发展的瓶颈。 骨骼肌干细胞具有能耐受缺血环境；移植后很快分化成具有收缩性的骨骼肌等特点。但其数量极少，且与年龄增长负相关，分离纯化的技术难度大。而最大的缺陷在于骨骼肌干细胞并不能与受体心肌细胞形成闰盘连接，不能整合到受体心肌细胞中形成生理性功能合胞体，导致骨骼肌干细胞移植后往往发生心室节律紊乱，使其应用价值受到不少学者质疑。 骨髓间充质干细胞具有取材方便、体外分离纯化相对简单、易扩增等特点；同时由于它们存在独特的免疫耐受性（其原因可能是缺乏Ⅱ型HLA和免疫共刺激因子B7[5]），能够在异种异体环境中存活，而不被受体免疫系统所排斥。所以骨髓间充质干细胞是用于心肌移植的优势细胞之一，被广泛关注。 胎肝干细胞（Embryonic hepatic stem cells，EHSCs）是近年逐渐被关注的一类间充质干细胞细胞。有学者[8]认为胚胎肝脏发育早，胎肝干细胞可能具有比骨髓干细胞更强的增殖分化能力和更低的免疫原性和免疫活性。有研究者已就其向类心肌细胞方向分化做出了初步探讨。胎肝干细胞有望用于心肌移植的优势细胞之一。 研究目的：1.优化小鼠EHSCs的分离、纯化、扩增的方法；2.比较不同胎龄的EHSCs生物学性状，遴选出获得小鼠EHSCs的合适时期；3.通过体外诱导分化实验了解EHSCs是否具有分化为类心肌细胞的潜能；4.比较不同的诱导条件下，EHSCs向类心肌细胞方向的分化情况。 方法与结论： 第一部分：探讨小鼠EHSCs分离、纯化、扩增方法，比较不同胎龄的小鼠EHSCs的生物学性状。采用胶原酶加EDTA消化法和差速贴壁法分离不同胎龄的小鼠EHSCs，用含15％优等胎牛血清的L-DMEM培养液培养，通过反复传代对EHSCs进行纯化和扩增培养。结果提示：13.5d胎龄组EHSCs形态均一，生长状态良好，干细胞特性明显，是相对原始的干细胞。随胎龄增加，16.5d胎龄组和19.5d胎龄组EHSCs形态差异渐大，生长状态渐次，逐渐向具有肝细胞和胆管细胞标志的双显型干细胞方向过渡。 结论：1.13.5d胎龄的EHSCs，是相对原始的干细胞，可能具有更广泛的分化潜能。2.通过上述方法，可获得数量可观，性质稳定的EHSCs。 第二部分：探讨不同的诱导条件下，EHSCs向心肌细胞方向的分化情况。取3-4代细胞以1.5×104/c㎡密度接种于培养板上。当细胞接近80％-90％融合时，用不同浓度的诱导剂诱导细胞24h，然后置于37℃，5％CO2，20％O2，饱和湿度的孵箱中培养。倒置显微镜下观察细胞形态变化，发现在下述条件下细胞发生了向心肌细胞方向的分化：诱导剂为5-aza5μmol/L+DMSO0.8％，孵育时间为24h，培养液是含有15％FCS、1％非必需氨基酸、1％左旋谷氨酸的L-DMEM培养基。培养条件是37℃，5％CO2，20％O2，饱和湿度的孵箱。结果提示：诱导3周后，分化细胞呈小圆形，具有相互聚集形成球形细胞团结构的趋势；诱导后第4周，细胞免疫组化染色提示转化细胞表达心肌特异性肌钙蛋白T（troponin T，TnT）和α-肌动蛋白（α-actin）。 结论：1.小鼠EHSCs具有向心肌细胞方向分化的潜能；2.不同种属来源的细胞发生分化的时间和过程并不完全相同，转化为成熟心肌细胞所需时间也不同。 总结： 1.利用改良的差速贴壁法，可以从胎肝中分离出具有良好贴壁能力的干细胞群，方法较为简单易行。 2.胎龄为13.5d的小鼠胎肝，单位重量的胎肝中含有更多的具有形成集落能力的干细胞。 3.胎龄为13.5d的小鼠胎肝干细胞处于相对原始的未分化阶段。 4.小鼠EHSCs在5-aza和DMSO联合诱导的情况下在体外可向类心肌细胞方向分化。 5.诱导剂组合5-aza5μmol/L+DMSO0.8％能诱导EHSCs在体外向心肌细胞方向分化，加大诱导剂剂量并不能提高诱导效率。 6.诱导剂组合5-aza5μmol/L+DMSO0.8％诱导EHSCs在体外向心肌细胞方向分化的合理作用时间为24h，延长诱导剂的作用时间，并不能提高诱导效率。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

前言

第一部分不同胎龄的胎肝干细胞体外分离扩增及生物学性状的研究

1实验材料

2实验方法

3结 果

4讨论

第二部分体外诱导胎肝干细胞向心肌细胞方向分化的研究

1实验材料

2实验方法

3结果

4讨论

全文总结

参考文献

文献综述：成体干细胞在心血管疾病中的研究进展

致谢

学习期间撰写和发表的文章