TNNI3K基因过表达诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化及机制研究

摘要

目的:
　　TNNI3K是一种具有丝裂酶原蛋白激酶活性的心肌特异性激酶，因与cTnI相互作用而得名。近十几年来研究发现，一方面，TNNI3K可能参与了心脏向心性肥厚、PR间期延长及加速扩张性心肌病的进展等病理过程;另一方面，TNNI3K在减少缺血性心室重构，增强心肌功能，诱导心肌细胞分化以及增加心肌细胞数量等方面发挥心脏保护作用。染色体定位分析提示TNNI3K基因位于1号染色体短臂3区1带(1p31.1-p31.2)。该区域恰与心脏房室间隔缺损易患基因所在区域邻近。我们推测TNNI3K可能参与了心脏发育过程的某个阶段及心肌细胞分化过程。因此，本研究旨在探讨TNNI3K在小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cell，mESC)向心肌细胞分化过程中的作用及相关分子机制，以期阐明TNNI3K与心肌细胞分化的关系。
　　方法:
　　首先，通过检测干细胞全能性表面标志物SSEA-1和Oct-4、碱性磷酸酯酶阳性试验以及H.E染色实验鉴定mESC的全能性。继而，采用传统的悬滴法培养mESC形成EB，除去LIF使其自分化为跳动的心肌细胞，通过real-time PCR检测心肌细胞相关基因的相对表达量，western blotting检测心肌细胞特异性标志物蛋白相对表达量，细胞免疫荧光检测心肌细胞特异蛋白的定位表达，以及TEM观察心肌细胞超微结构特异标志物肌纤维等方法鉴定所分化的心肌细胞。进一步，采用慢病毒分别携带hTNNI3K基因和siRNA永久性转染mESC并分别分化为心肌细胞，通过real-time PCR检测各组心肌细胞特异性基因的相对表达量，western blotting检测心肌细胞特异性标志物蛋白的相对表达量，细胞免疫荧光共定位检测心肌细胞特异性蛋白时空相对表达，FCM分选cTnT+细胞率等判断hTNNI3K对心肌细胞分化的影响。此外，我们选取了Connexin40、Connexin45和Ctnt分别作为检测了心房肌细胞、窦房结细胞和心室肌细胞表面标志物基因的相对表达量。最后，我们对hTNNI3K组、shRNA组以及各自对照组进行western blotting检测MAPK信号通路相关蛋白的相对表达。
　　结果:
　　研究结果表明，mESC表面蛋白分子SSEA-1和Oct-4表达呈阳性（绿色荧光），ALP高表达呈蓝紫色，H.E染色核质比＞＞1。正常自分化的心肌细胞相关基因和蛋白表达呈现时空特性;分化16d时细胞免疫荧光显示MLC2、cTnI、cTnT以及α-actinin在胞浆高表达（绿色荧光），肌节清晰可见。TEM显示心肌细胞独有的肌纤维亚细胞结构。hTNNI3K组心肌细胞相关基因高表达(P＜0.05)。Western blotting显示心肌特异性蛋白MLC2、cTnT、cTnI、a-actinin等显著高于其对照组(p＜0.05)，且细胞免疫荧光双染结果显示MHC6蛋白提前表达。FCM结果显示cTnT+阳性细胞率显著高于对照组(p＜0.05)。干扰shRNA组不仅cTnT+阳性细胞率显著低于对照组(P＜0.05)，而且心肌特异蛋白也显著低于对照组(p＜0.05)，MHC6蛋白表达延后。通过检测Connexin4、Connexin40和Ctnt相对表达量，我们发现，这三个基因表达量无统计学差异(P＞0.05)。通过检测MAPK信号通路相关蛋白发现，hTNNI3K组P-p38、P-ERK和P-JNK均被抑制，且P-P38和P-JNK蛋白抑制更明显，而Flag-only组、shRNA组和non-sense RNA组信号通路蛋白均正常表达。
　　结论:
　　TNNI3K基因过表达促进mESC向心肌细胞分化，且MAPK信号通路可能参与了该基因诱导mESC分化为心肌细胞的过程。

目录

摘要

前言

研究对象与方法

一、研究对象

二、实验试剂及仪器

三、实验方法

研究结果

一、小鼠胚胎干细胞培养与鉴定

二、慢病毒TNNl3K过表达与干扰对心肌细胞分化的影响

讨论

参考文献

综述

缩略语表

致谢

个人简历

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