原发性免疫缺陷病的临床特征和分子特点分析

摘要

第一部分 24例Wiskott-Aldrich综合征临床特征与分子特点分析
　　 目的：探讨来自中国23个不同家系的24例Wiskott-Aldrich综合征患儿的临床特征及分子特点。
　　 方法：2007年4月～2009年7月收集在重庆医科大学附属儿童医院治疗的24例疑诊Wiskott-Aldrich综合征患儿外周静脉血，采用流式细胞术（FCM）检测患儿外周血单个核细胞（PBMC）中WASP表达。扫描电镜观察患儿外周血淋巴细胞形态。PCR扩增WASP基因序列并直接双向测序分析24例患儿及亲属基因突变情况。总结确诊WAS患儿的临床资料。
　　 结果：24例患儿均为男性，具有典型WAS的临床特征。其中2例发生自身免疫性溶血性贫血（AIHA），1例患视网膜母细胞瘤（RB）。5例淋巴细胞扫描电镜（SEM）检查可见典型微绒毛异常。21例患儿采用FCM检测外周血PBMC的WASP表达，18例患儿WASP不表达，3例WASP部分表达。WASP基因分析在23例患儿中发现20种不同突变，包括错义突变5例，无义突变4例，缺失突变4例，插入突变3例，拼接位点突变6例，复合突变1例。其中新型突变7例。突变分布于WASP基因7个外显子和4个内含子。1例WAS患儿在WASP基因编码区未发现基因突变。3例WASP部分表达患儿WASP基因分析发现1例WASP基因第二位点突变。22例明确基因诊断的患儿的母亲及相关亲属进行WASP基因检测，在20个家系中发现23例WASP基因突变携带者。5例WAS患儿接受造血干细胞移植，移植后5例均正常表达WASP，但1例死于爆发性巨细胞病毒感染。
　　 结论：通过对24例WAS患儿基因分析，发现7个新型WASP基因突变位点。在中国人群中报道1例WASP基因第二位点突变。FCM检测和WASP基因分析能确诊并检出携带者，有利于WAS患儿的及时治疗和相关的遗传咨询。
　　 第二部分 21例先天性无丙种球蛋白血症的临床特征和分子特点
　　 目的：分析和探讨21例先天性无丙种球蛋白血症患儿的临床特征及分子特点。
　　 方法：2008年3月～2010年2月收集在重庆医科大学附属儿童医院就诊的21例先天性无丙种球蛋白血症患儿及亲属外周静脉血，采用RT-PCR扩增BTK基因序列并直接双向测序分析患儿及亲属基因突变情况。对未发现BTK基因突变的患儿进一步采用PCR扩增常染色体隐性遗传无丙种球蛋白血症的相关基因，包括μHc，λ5，Igα和Igβ。收集21例先天性无丙种球蛋白血症患儿的临床资料。
　　 结果：21例先天性无丙种球蛋白血症患儿起病年龄0.9±0.5岁，诊断年龄6.3±3.0岁。呼吸道感染是最常见的临床表现（n=20，95.2％），其它依次为关节炎（n=8，38.1％），中耳炎（n=8，38.1％），腹泻（n=6，28.6％），皮肤感染（n=6，28.6％）和脑膜脑炎（11=1，4.8％）。1例患儿发生前B细胞白血病，2例患儿因反复肺炎进展为慢性肺疾病。BTK基因分析在18例患儿中发现16种不同突变，其中包括7种新型突变（del373-441，504 del G，537 del C，851 del A，1637 G>A，1879 T>C，del1482-1882）。突变类型包括缺失突变6例，错义突变4例，无义突变3例，拼接位点突变5例。3例患儿未见BTK基因突变。18例BTK基因突变中10例位于酪氨酸激酶区，4例位于血小板.白细胞C激酶底物同源区，3例位于Src同源区3，1例跨越酪氨酸激酶同源区、Src同源区3、Src同源区2和酪氨酸激酶区。对BTK基因未见突变的3例患儿进行常染色体隐性遗传无丙种球蛋白血症的相关基因筛选，发现1个μHC基因的复合突变（1956 G>A，170-175 insert C）。
　　 结论：通过对21例中国先天性无丙种球蛋白血症患儿分子特点分析，发现7个BTK基因的新型突变。在中国人群中首次报道μHC基因突变的临床特征。基因分析有助于先天性无丙种球蛋白血症患儿的明确诊断，有利于发现携带者和进行遗传咨询。
　　 第三部分 IL-7Rα基因缺陷导致严重联合免疫缺陷病和Omenn综合征的临床特征和分子特点
　　 目的：探讨IL-7Rα基因缺陷导致严重联合免疫缺陷病和RAG1基因突变导致Omenn综合征的临床特征和分子特点。
　　 方法：2008年2月～11月在重庆医科大学附属儿童医院收治3例男性患儿，均在生后早期出现反复、严重的感染，抗生素治疗效果较差。其中2例患儿全身反复出现大片红色斑丘疹、脱屑及肝脾肿大。采用PCR方法扩增患儿及父母IL-7Rα基因和RAG1/RAG2基因，PCR产物直接进行双向序列测定。采用25个TCRVβ亚家族的特异性正向引物和1个共同的Cp反向引物扩增TCRVβ进行克隆谱型分析。采用STR分析除外母源性T细胞植入。
　　 结果：患儿1的免疫球蛋白IgG686.7mg/dL，IgA24.9 mg/dL，IgM20.6 mg/dL，IgE2.3IU/ml。淋巴细胞分类T淋巴细胞（CD3+）0，B淋巴细胞（CD19+）58％，NK细胞（CD16+CD56+）42％。基因分析患儿为IL-7Rα基因的复合杂合突变（638 C>T；IVS4（+1）G>A），父母均为携带者。第4内含子剪接位点突变（IVS4（+1）G>A）为首次报道的突变类型。RT-PCR检测发现患儿IL-7Ra mRNA表达明显降低。患儿IL-7RαcDNA经巢式PCR扩增并进行T-A克隆，测序发现外显子4出现64个核苷酸缺失（496-559 del，K158fsX160）。患儿2的免疫球蛋白IgG1150mg/dL，IgA80mg/dL，IgM180mg/dL，IgE5.4IU/ml。淋巴细胞分类T淋巴细胞（CD3+）69％，B淋巴细胞（CD19+）3％，NK细胞（CD16+CD56+）27％。患儿3免疫球蛋白IgG4847mg/dL（IVIG后），IgA46mg/dL，IgM129mg/dL，IgE1.2IU/ml。淋巴细胞分类T淋巴细胞（CD3+）21％，B淋巴细胞（CD19+）1％，NK细胞（CD16+CD56+）69％。PHA刺激后患儿2和3淋巴细胞增殖均极度低下。STR分析除外患儿2和3母源性T细胞植入可能。RAG1基因组DNA测序发现患儿2为RAG1基因的复合突变（G1983A，R624H；C2444T，R778W）。患儿3为RAG1基因的纯合缺失突变（del2302，1729X）。TCRVβ克隆谱型分析显示患儿2的25个TCRVβ亚家族均为单克隆或寡克隆，患儿3的14个TCRVβ亚家族为单克隆或寡克隆，11个TCRVβ亚家族极弱或缺失。
　　 结论：在中国人群中首次报道了2例明确基因诊断的Omenn综合征和1例IL-7Rα基因缺陷导致严重联合免疫缺陷病的临床特点和基因突变类型，发现1个RAG1基因和1个IL-7Rα基因的新型突变。