超声辐照载10-HCPT微泡在小鼠H22肝癌移植瘤的定位释放及治疗研究

摘要

10-羟基喜树碱(HCPT)是从珙桐科落叶植物喜树的种子或根皮中提出的一种生物碱,是一种常用的抗肿瘤药物。其抗肿瘤作用机制十分明确,是一种抑制DNA拓扑异构酶Ⅰ活性的化合物。它对许多实体肿瘤具有明显的抗肿瘤活性,与常用抗肿瘤药物无交叉耐药性。该类药物的抗肿瘤活性部位是其分子结构中的内酯环,当喜树碱类药物以内酯形式给药时,其抗肿瘤活性作用可显著提高。但10-HCPT本身不溶于水,目前临床所用制剂采用碱性溶液调节酸碱度,使其结构中的α-羟基内酯环打开而溶解,这样不仅会降低疗效,而且会导致严重的毒副作用,如白细胞减少、血小板减少以及出血性小肠结肠炎等。为了增加其疗效同时减少毒副作用,对于10-HPT新剂型的研究引起了广泛的兴趣。脂质超声微泡造影剂由磷脂双分子层包裹氟碳类气体形成,除作为一种超声造影剂外,近年来还被尝试用于携载基因或药物进行靶向治疗。本实验将在制备载10-CPT的脂质超声微泡的基础上,应用超声定向破坏载药微泡介导药物定位释放技术观察药物在小鼠H22肝癌移植瘤内定位控释效果及抗肿瘤治疗的效果,以期为10-HCPT的新剂型研制提供新的思路,也为10-HCPT靶向抗肿瘤治疗及定位控释提供依据。本主要包括以下三部分：
　　 第一部分：
　　 目的：制备载10-HCPT脂质超声微泡(HLM),并对其基本性质进行鉴定。
　　 方法：采用声振及薄膜干燥法的方法将10-HCPT充分分散溶解于脂质膜中,然后用机械振荡的方法制备出载药微泡。在溶解磷脂时加入微量的DiI即可得到荧光标记的HLM。用DFY型超声图像定量分析软件结合光学显微镜计算微泡浓度,分析粒径。用高效液相色谱法测定HLM样本中的10-HCPT含量。用HLM对小鼠H22肝癌移植瘤进行显影并局部超声辐照破坏HLM。
　　 结果：普通光镜及荧光模式下观察,该载药微泡形态圆整,大小均一。DFY型超声图像定量分析软件分析HLM的粒径范围是0.63～1.93μm,平均粒径为1.32±0.18μm,经漂洗稀释后度约为1.97×109/ml。高效液相测定其包封率为76.32％,载药量为21.81％。肿瘤造影结果表明HLM可以增强小鼠皮下肿瘤的显像并可被超声辐照破坏。
　　 结论：成功制备了载10-HCPT脂质超声微泡,该载药微泡具有良好的物理性质及较高的包封率和载药量,能增强小鼠皮下肿瘤的显像并可被超声辐照破坏。
　　 第二部分：
　　 目的：建立小鼠H22肝癌移植瘤模型。应用载10-HCPT脂质超声微泡(HLM),结合超声定位破坏微泡的方法实现10-HCPT在H22移植瘤的定位释放。
　　 方法：培养H22细胞,收集对数生长期细胞,用PBS液重悬后接种至小鼠背臀部皮下,待小鼠移植瘤长至1cm左右进入实验。42只荷瘤小鼠进入实验,分为A组和B组。A组小鼠12只分为单独荧光标记HLM组和超声+荧光标记HLM组,于处理1h后断颈处死小鼠剥取肿瘤,立即进行冷冻切片,用荧光显微镜观察荧光标记的HLM在肿瘤中的分布情况。B组小鼠30只分为:超声+10-HCPT注射液组、超声+空白脂质微泡+10-HCPT注射液组、单独HLM组、超声+HLM组及生理盐水对照组。于处理1h后处死小鼠剥取肿瘤及心、肝、脾、肺、肾,用高效液相法测定各组织内药物浓度。
　　 结果：病理切片结果见荧光素在肿瘤的分布超声+荧光标记HLM组明显多于单独荧光标记HLM组。药物浓度检测结果显示:1h后肿瘤内10-HCPT浓度最高的是超声+HLM组。104-1CPT在其他组织中的浓度分布表现为使用HLM的两组显著高于使用10-HCPT注射液的两组(P<0.05)。
　　 结论：局部超声辐照破坏HLM的方法能定位释放10-HCPT,提高移植瘤内的10-HCPT含量,同时脂质微泡作为10-HCPT的载体能延长其体内循环时间。
　　 第三部分：
　　 目的：研究超声定位破坏载10-HCPT脂质超声微泡(HLM)的方法对H22移植瘤的生长抑制效应。
　　 方法：将30只荷瘤鼠随机分为5组:超声+10-HCPT注射液组、超声+空白脂质微泡+10-HCPT注射液组、单独HLM组、超声+HLM组及生理盐水对照组。需要超声辐照的组经小鼠尾静脉注入药物或微泡后立即以超声辐照瘤体部位,以上各组小鼠都隔天治疗一次,共治疗五次。治疗前后及治疗过程中用超声观察并计算瘤体大小,根据瘤体大小绘制肿瘤生长曲线并计算抑瘤率。最后剥取瘤块,用原位末端凋亡法(TUNEL染色)检测肿瘤组织的细胞凋亡,用免疫组化检测肿瘤组织PCNA(增殖细胞核抗原)的表达,并对结果进行分析。
　　 结果：超声+HLM组的抑瘤率明显高于其他各组(P<0.05)。TUNEL染色结果表明各处理组肿瘤细胞的凋亡率均高于对照组(P<0.05),其中超声+HLM组肿瘤细胞的凋亡率又高于其他各处理组(P<0.05)。免疫组化检测PCNA表达的结果表明,各处理组肿瘤细胞的增殖均低于对照组(P<0.05),其中超声+HLM组肿瘤细胞的增殖率又低于其他各处理组(P<0.05)。
　　 结论：超声定位辐照HLM的方法可显著提高10-HCPT对H22移植瘤的生长抑制效应,有望成为一种新的靶向抗肿瘤治疗手段。