外源性rhS100A6对七株转化细胞系和肿瘤细胞系的体外作用及血清和肿瘤组织中S100A6水平随兔肝VX2移植瘤发展进程的动态变化

摘要

研究背景和目的：本研究拟建立兔肝VX2移植瘤模型，检测在荷瘤过程中S100A6在血清中的含量及在转移瘤组织中表达的动态变化，为进一步明确S100A6在肿瘤发生发展中的作用积累实验依据。
　　 方法：
　　 1.重组人S100A6蛋白的制备：将pGST-Moluc-hS100A6转化大肠杆菌BL21，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导rhS100A6表达，谷胱甘肽-琼脂糖4B球珠分离纯化、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western-blotting鉴定，BCA法定量，分装后-80～C保存备用。
　　 2.细胞增殖及迁移的检测：分别以终浓度均为3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、100μg/ml、300μg/ml、1000μg/ml的rhS100A6作用于人胚肾细胞HEK293、人气道上皮细胞9HTE、小鼠胚胎成纤维细胞MEF、中国仓鼠卵巢细胞CHO、小鼠间充质干细胞C3H10T1/2、兔鳞状细胞癌细胞VX2和人骨肉瘤细胞143B。MTT法检测其增殖。根据该实验结果，筛选出30μg/ml作为后续实验的终浓度。在30μg/ml的rhS100A6作用上述细胞后，用MTT法连续测定5天内细胞增殖的变化，用细胞划痕实验和Transwell小室检测细胞迁移能力的变化。
　　 3.细胞内β-catenin水平的检测：30μg/ml的rhS100A6处理5种转化细胞系，分别使用免疫细胞化学法和Western-blotting法检测细胞内β-catenin表达水平。
　　 4.兔肝VX2移植瘤模型的建立：取自种兔的VX2鳞癌组织去包膜后，切成1mm×1mm×1mm小块，接种至肿瘤兔左肝下叶。术后密切观测肿瘤兔一般情况及肿瘤生长情况。
　　 5.标本采集：分别于接种后第7、12、17、19、21、23、25、27及29天处死动物，采集血清，分装后-80℃保存备用；采集肝内、网膜、肺上的转移瘤组织行石蜡切片。
　　 6.血清及转移瘤组织中S100A6含量的检测：用包被S100A6抗体的酶标板行ELISA检测血清中S100A6的含量；石蜡包埋组织切片后，用S100A6单克隆抗体行免疫组织化学检测S100A6在转移瘤中的表达。
　　 结果：
　　 1.重组蛋白rhS100A6制备成功。纯化后的诱导表达产物经过SDS-PAGE后，考马斯亮蓝染色，可见36KD处的GST-S100A6条带，经Quanity one分析纯度达92％：以S100A6抗体，通过SDS-PAGE/Western-blotting法检测纯化后的GST-S100A6，出现阳性杂交条带。即rhS100A6制备成功。以标准化的BSA为参照品，以BCA法测定其浓度并绘制蛋白浓度标准曲线，由此曲线推算洗脱的rhS100A6浓度为12.3 mg/ml，则1L菌液中可得6.15mg的rhS100A6。
　　 2.外源性rhS100A6对这5株转化细胞系的增殖无明显影响，但是对2株肿瘤细胞系的增殖具有抑制作用，并呈一定的浓度、时间依赖性。1）浓度依赖性：5株转化细胞系在各浓度的rhS100A6处理后，其OD值与实验对照组相比，差异不具统计学意义；
　　 3.μg/ml和10μg/ml的rhS100A6对2株肿瘤细胞系的增殖无明显影响；而随后的4个浓度的rhS100A6处理致VX2细胞的OD值分别较GST组下降19.3％、26.4％、37.8％和47.1％，143B细胞的OD值分别较GST组下降17.4％、23.8％、33.7％和35.2％。2）时间依赖性：根据上述结果，选用30μg/ml浓度作时间依赖实验。在5天观察时间内，5株转化细胞系的rhS100A6组的OD值与GST组相比，差异不具统计学意义；而2株肿瘤细胞系的OD值从干预后第3天起开始降低，与GST组相比，VX2细胞第3-5天的OD值分别下降13.1％、16.3％和17.9％，143B细胞第3-5天的OD值分别下降11.7％、14.7％和16.6％。
　　 提示：外源性rhS100A6对这5株转化细胞系的增殖无明显影响，但是对2株肿瘤细胞系的增殖具有抑制作用，并呈浓度、时间依赖。3.外源性rhS100A6对这5株转化细胞系的迁移无明显影响，但是对2株肿瘤细胞系的迁移具有抑制作用。
　　 1）5株转化细胞系：
　　 （1）细胞划痕实验：30μg/ml的rhS100A6作用于5种转化细胞系，各个观测点的细胞迁移率与GST组的差异无统计学意义。（2）Transwell实验也进一步验证了上述结果：30μg/ml的S100A6作用于这5种细胞后，实验组穿膜细胞数与GST组的差异无统计学意义（P>0.05）；同时，用33％醋酸溶液洗脱被甲基紫染色后的细胞，在490nm处读取其OD值（该值与穿膜细胞数成正比），该结果也进一步证实实验组与GST组差异无统计学意义（P>0.05）。提示，外源性rhS100A6对这5种转化细胞系（HEK293、9HTE、MEF、CHO和C3H10T1/2）的迁移无明显影响。
　　 2）2株肿瘤细胞系：
　　 （1）细胞划痕实验：30μg/ml的rhS100A6作用于VX2和143B，24小时后的细胞迁移率较GST组分别降低17.2％（P<0.05）和16.4％（P<0.05），差异具有统计学意义。
　　 （2）Transwell实验证实，30μg/ml的rhS100A6作用于VX2和143B后，其穿膜细胞数较GST组分别减少10.1％（P<0.05）和11.2％（P<0.05）。同时，用33％醋酸洗脱被甲基紫染色的细胞，VX2细胞实验组490nm处的OD值较GST组降低12.3％（P<0.05）。提示，外源性rhS100A6对VX2和143B细胞的迁移有抑制作用。
　　 综上：外源性rhS100A6对这5株转化细胞系（HEK293、9HTE、MEF、CHO和C3H10T1/2）的迁移无明显影响，但是对2株肿瘤细胞系（VX2和143B）的迁移具有抑制作用。
　　 4.外源性rhS100A6上调5株转化细胞系的β-catenin水平。免疫细胞化学显示：实验组β-catenin阳性染色的平均光密度值均高于GST组，HEK293、9HTE、MEF、CHO和C3H10T1/2分别增高25.4％、15％、22.1％、22.7％和28％，差异均具有统计学意义（P<0.05）。Western-blotting法检测结果也与上述结果一致：实验组阳性条带与内参条带的灰度比值较GST组均有升高，HEK293、9HTE、MEF、CHO和C3H10T1/2分别增高11.4％、21.9％、13％、14.8％和10.1％，差异具均有统计学意义（P<0.05）。提示：外源性rhS100A6能够上调这5株细胞的β-catenin水平。
　　 5.兔肝VX2移植瘤模型建立成功。实验共接种45只兔，成功建立兔肝VX2移植瘤模型45只，接种成功率100％。接种后肿瘤生长迅速，肿瘤兔存活期不超过30天；第15天前的兔体内未见明显转移灶，第17天时可见肝内转移及网膜转移，第25天可见肺转移，并开始表现恶病质。肿瘤组织病理切片证实为鳞状细胞癌。
　　 6.肿瘤兔血清S100A6含量随荷瘤进程呈进行性降低。从荷瘤第7天起到第29天，兔血清中S100A6的含量分别较对照组减少12.1％（P=0.237）、20.O％（P=0.105）、37.6％（P=0.01）、79.9％（P=0.01）、89.9％（P=0.01）、92.9％（P=0.01）、98.3％（P=0.01）、98.5％（P=0.01）和99.0％（P=0.01），即从第17天起（即发现肝内转移和网膜转移的时间），血清含量的差异有显著性。提示：肿瘤兔血清S100A6含量随荷瘤进程呈进行性降低。
　　 7.S100A6在肝内、网膜和肺的转移肿瘤组织中的表达随荷瘤进程进行性降低。
　　 免疫组织化学显示：在肝内、网膜和肺转移肿瘤组织中的S100A6阳性染色程度呈进行性降低，回归分析提示差异具有显著性（肝内肿瘤P=0.01，网膜肿瘤P=0.01，肺内肿瘤P=0.04）。提示：S100A6在肝内、网膜和肺的转移肿瘤组织中的表达随荷瘤进程呈进行性降低。
　　 结论：
　　 1.通过转化重组质粒到大肠杆菌，IPTG诱导表达和分离纯化，获得高纯度的rhS100A6蛋白。
　　 2.外源性rhS100A6对5株转化细胞系（人胚肾细胞HEK293、人气道上皮细胞9HTE、中国仓鼠卵巢细胞CHO、小鼠胚胎成纤维细胞MEF和小鼠间充质干细胞C3H10T1/2）的增殖及迁移无明显影响。
　　 3.外源性rhS100A6对兔鳞状细胞癌细胞VX2和人骨肉瘤细胞143B的增殖及迁移具有一定的抑制作用，并呈浓度、时间依赖。
　　 4.外源性rhS100A6能上调上述5株转化细胞系内β-catenin水平。
　　 5.随兔肝VX2移植瘤模型的进程，其血清S100A6水平进行性降低，并且在转移伊始（第17天）骤降。
　　 6.在转移肿瘤组织中，S100A6的表达也呈逐步降低趋势。
　　 7.外源性rhS100A6抑制VX2的增殖、迁移及兔肝VX2移植瘤模型兔血清和转移肿瘤组织中S100A6的进行性降低，提示：1）S100A6对肿瘤VX2具有抑制性作用；2）S100A6表达的下调可能是促进肿瘤发展的因素之一，因此，上调S100A6的表达可能延缓该发展进程；3）血清S100A6可望成为肿瘤VX2转移的标志物。