矽尘暴露人群血清生物标志物的筛选及其相关功能的初步研究

摘要

矽肺(silicosis)是由于长期吸入大量游离二氧化硅(siO2)粉尘引起的以肺间质纤维化为主的全身性疾病,在我国是危害最严重的职业病之一。在我国平均每例尘肺病人每年经济损失约为3.41万元,每年仅因尘肺病造成的直接经济损失达140多亿元,每年新增尘肺病例造成的经济损失达6亿元。近年来矽肺病的流行呈现出群发性、低龄化以及致残率高的新特点,这给矽肺的防治工作带来了新的挑战。目前已发现许多对矽肺的诊断有价值的血清生物标志物,如肺特异性的克拉拉细胞蛋白(cc16)、肺表面活性物质D(SP-D)作为诊断指标仍存在敏感性、特异性不足的缺点,不同类型的肺间质病之间这些指标重叠较大；而支气管肺泡灌洗液的化学及细胞学检查仅能作为影像学诊断的补充。运用新技术手段筛选高特异性、敏感性的标志物将对矽肺的早期防治起到重要的推动。液体芯片飞行时间质谱技术是一种基于磁珠分选与基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)联合应用的蛋白质鉴定技术,可直接检测临床未经特殊处理的血清、尿液、脑脊液或浆膜腔积液等标本,对疾病(特别是肿瘤)的诊断有较高的敏感性和特异性。本研究采用液体芯片飞行时间质谱技术检测矽尘暴露人群血清蛋白的表达,筛选出矽肺发病早期的生物标志物建立矽肺早期诊断的人工神经网络诊断模型并对鉴定出的标志物进行相关功能的初步研究。
　　 研究目的：
　　 应用液体芯片飞行时间质谱技术筛选矽尘暴露人群早期诊断血清生物标志物,并对鉴定出的生物标志物进行初步功能研究。
　　 研究方法：
　　 矽尘暴露人群85例为山西省阳泉市某耐火材料厂接触游离二氧化硅粉尘的工人,统一摄高千伏X射线后前位胸片(120-150KV、100mA、0.03-0.05s),由具有诊断资格的诊断专家组按照《尘肺病诊断标准GBZ70-2002》进行诊断,分为矽尘暴露组(无尘肺0期)、可疑矽肺组(无尘肺0+期)和Ⅰ期矽肺组；30例非暴露正常对照组为某单位年度体检人员,均无矽尘暴露史。
　　 本研究首先应用invitrogen公司生产的Dynabeads RPC18磁珠,对矽尘暴露人群和非暴露正常对照组的血清进行蛋白质(多肽)的分选,然后对分选后的蛋白(多肽)采用MALDI-TOF-MS的一级质谱技术和ClinProTools分析软件进行差异蛋白峰的筛选,同时应用Matlab分析软件建立人工神经网络诊断模型,最后对筛选出的差异蛋白质峰采用MALDI-TOF-MS二级质谱技术进行氨基酸序列鉴定。
　　 按照二级质谱鉴定出来的氨基酸序列人工合成差异蛋白,并用不同浓度的蛋白溶液作为刺激物,观察其对矽肺形成过程中的靶细胞人胚肺成纤维细胞(MRC-5)的影响。
　　 研究结果：
　　 1.一级质谱寻找差异显著峰结果:利用神经网络算法(SNN)建立模型进行各组间两两比较,发现0期与0+期、0期与Ⅰ期、0+期与Ⅰ期比较,其识别率分别为64.35％、84.38％和73.49％,其交叉验证能力分别为63.14％、52.82％和69.07％；而正常对照组(control)与0期、正常对照组与0+期、正常对照组与Ⅰ期比较,其识别率分别为89.23％、98.52％和98.96％交叉验证能力分别为87.66％、94.20％和85.53％。
　　 由上可知,0期与0+期、0期与Ⅰ期、0+期与Ⅰ期比较,其识别率和交叉验证能力都较差；而正常对照组(control)与0期、正常对照组与0+期、正常对照组与Ⅰ期比较,其识别率和交叉验证能力都较好。因此,仅对0期、0+期、Ⅰ期与正常对照组的差异显著峰进行提取,共得到5个差异峰(P<0.01),其中5081Da和5066Da为表达上调的蛋白峰,2021da、3954da和1777da为表达下调的蛋白峰。
　　 2.二级质谱鉴定差异显著峰氨基酸序列结果:根据二级质谱仪器要求,选择分子量<3KDa的峰2021Da和1777Da进行二级质谱鉴定其氨基酸序列结果两蛋白质峰同为补体C3的一个片段C3f。
　　 3.矽尘暴露人群接尘量与差异峰强度相关性分析:接尘量与5081Da、5066Da、3954Da、2021Da和1777Da5个差异显著峰的峰强的相关系数依次为r5081=0.039(P=0.614)、r5066=0.104(P=0.180)、r3954=-0.047(P=0.543)、r2021=-0.028(P=-0.714)、r1777=-0.016(P=0.853),5个差异蛋白峰强度与接尘量均不存在相关性。
　　 4.矽尘暴露人群人工神经网络诊断模型的建立:筛选出峰效果较好的2021Da、2554Da.、5066Da、8600Da.4个P(0.001的共同差异蛋白质峰建立矽尘暴露人群诊断模型,其区分矽尘暴露人群与正常对照组的特异性为100％,敏感性为90％,准确率为92.3％；该模型诊断O期、0+期和Ⅰ期的识别率分别为100％、93％和96％。
　　 5.不同浓度C3f刺激对MRC-5细胞上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF-β1表达量变化的影响:随着C3f浓度的增加,Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF-β1的表达量均呈进行性降低。与对照组相比,各浓度点均有显著差异(P<0.05)。
　　 6.不同浓度C3f刺激对MRO-5胞质中TGF-β1表达量变化的影响:随着C3f浓度的增加,MRC-5胞质中TGF-β1的积分光密度值呈进行性降低,各浓度点均有显著差异(P<0.05)
　　 研究结论：
　　 1.运用液体芯片飞行时间质谱技术的一级质谱寻找矽尘暴露人群差异蛋白,并成功建立了矽尘暴露人群人工神经网络诊断模型。
　　 2.运用液体飞行时间质谱技术的二级质谱技术鉴定出1777Da和2021Da同为C3f,后续的细胞功能研究证明C3f能够减少MRC-5细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原和TGF-β1的形成。
　　 综上所述,本研究成功建立的矽尘暴露人群人工神经网络诊断模型为矽肺的早期诊断提供了一种全新而有效的方法,后续对差异蛋白C3f功能的初步研究结果也为进一步探讨矽肺发病的免疫机制提供了研究线索。