胰岛素及PI3K/AKT信号通路抑制剂对人正常肝细胞AQP9表达的影响

摘要

目的：探讨胰岛素对人正常肝细胞膜上水通道蛋白AQP9表达的动态变化及P13K-AKT信号传导通路在胰岛素调控AQP9表达的作用及意义。
　　 方法：正常成人L-02肝细胞株,用含10％胎牛血清的1640培养基传代培养。采用免疫细胞化学方法观察正常肝细胞株L-02中AQP9的表达部位。建立胰岛素浓度梯度肝细胞株模型:分别予以100nM/L、250nM/L、500 nM/L胰岛素浓度作用于呈对数增长期的正常肝细胞株L-02孵育24小时后收获细胞；建立时间梯度模型:加入胰岛素刺激后分别于3h、6h、12h、及24h收获细胞。建立药物刺激模型:于正常培养L-02肝细胞株中分别予以PI3K抑制剂LY294002、AKT抑制剂A-443654、MAPK抑制剂SB2030580刺激后再予以最佳浓度(500 nM/L)胰岛素刺激24h后收获细胞。收获细胞均通过RT-PCR检测各组肝细胞内AQP9mRNA变化、Western Blot检测各组肝细胞内AQP9蛋白表达变化。
　　 结果：免疫细胞化学结果显示AQP9的阳性产物在正常肝细胞株L-02中表达丰富,主要位于肝细胞膜上,而细胞浆和细胞核中无表达。成功建立了胰岛素浓度及时间梯度模型,AQP9表达从胰岛素浓度100nM/L开始表达降低,500nM/L时降低最明显,差异有统计学意义(p<0.01)；而在胰岛素以500nM/L作用细胞后,AQP9表达从3h开始转录逐渐降低,6 h与3 h无明显差异,而12 h时抑制作用最明显,差异有统计学意义(p<0.05)；PI3K抑制剂LY294002、AKT抑制剂A-443654处理细胞后再次予以胰岛素刺激AQP9蛋白表达较只有胰岛素作用细胞时表达增加,而MAPK抑制剂处理后则没有明显变化,差异有统计学意义(p<0.01)。
　　 结论：人正常肝细胞膜上AQP9的表达受胰岛素呈浓度及时间依赖调控,及胰岛素浓度越大及作用时间越长,AQP9的表达抑制越明显。应用PI3K及AKT特异性抑制剂后,胰岛素对AQP9表达的抑制作用减弱,而阻断MARA信号通路传导通路则无明显变化,由此说明PI3K/AKT信号传导通路参与了胰岛素对AQP9的调剂机制。