心梗大鼠循环血单个核细胞分泌TNF-α对MSCs迁移及心肌样分化的影响

摘要

目的：建立体外三室共培养模型,探讨心梗大鼠循环血单个核细胞分泌INF-α对MSCs迁移的作用和机制,以及对MSCs向心肌样细胞分化的影响。
　　 方法：⑴用trans-well小室自制三室共培养模型；冲取SD大鼠骨髓,采甩密度梯度离心和贴壁筛选法分离培养MSCs；清洁级健康SD大鼠14只,随机分为心肌梗死组(8只,结扎左冠前降支建立大鼠心肌梗死模型)及假手术组(6只,只穿线不结扎),第7日无菌心脏采血,密度梯度离心分离大鼠循环血单个核细胞；采用机械法和胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶联合消化法分离培养新生SD乳鼠心肌细胞。依次将单个核细胞、心肌细胞和DAPI标记的MSCs接种到三室模型的下、中、上室内,按照下室所加成分的不同,设立心肌梗死组(MI组)、TNF-α中和抗体组(TNF-α-NA组)、假手术组(Sham组)和空白对照组(BC组),每组设12个孔,进行避光共培养。⑵48h后,各组分别取6个孔,对迁移细胞进行荧光镜下计数及CD34和CD44免疫细胞化学染色鉴定,对穿越至上室聚碳酸膜底面的MSCs进行结晶紫染色评价细胞活性。ELISA法检测细胞培养液离心上清液TNF-α的含量,分析TNF-α含量与MSCs迁移数目的相关性。免疫荧光及western blot半定量检测MSCs表面粘附分子VCAM-1的表达情况。⑶各组其余6孔,每4d换液一次,共培养14d后,对迁移至中室的MSCs进行免疫荧光双标记检测心肌标志物cTnI及α-actin的表达情况。
　　 结果：①48h后,在MI组、TNF-α-NA组和Sham组,荧光显微镜下可见迁移至中室的胞核发蓝光的MSCs。与Sham组[12.28±2.74个比较,MI组单位视野细胞迁移数[23.72±4.28个]显著增加(p<0.05),在中和TNF-α的TNF-α-NA组,单位视野细胞迁移数[8.89±2.25个]显著减少(p<0.05),而BC组未见迁移细胞。免疫细胞化学染色检测示迁移细胞CD44阳性而CD34阴性,符合MSCs特性。迁移MSCs阳性表达VCAM-1。结晶紫染色显示穿越至上室聚碳酸膜底面的MSCs为活细胞。②与Sham组相比,MI组单个核细胞分泌TNF-α的量显著增高(p<0.05),TNF-α含量分别为11.12±6.02和23.95±8.44ng/L,且TNF-α含量与迁移MSCs数目呈正相关(r=0.976,p<0.05和r=0.969,p<0.05)。③与Sham组比较,MI组MSCs的VACM-1表达量显著升高(p<0.05),VACM-1表达量分别为0.78±0.12和0.97±0.07,中和TNF-α后VACM-1表达量显著降低[0.66±0.05,p<0.05],但中和TNF-α并未能完全抑制VCAM-1的表达。④共培养14d后,对中室细胞进行心肌标志物cTnI及α-actin免疫荧光双标记显示:迁移至中室与心肌细胞直接接触的部分MSCs阳性表达cTnI及α-actin,而未与心肌细胞相接触的MSCs不表达cTnI及α-actin。
　　 结论：⑴心肌梗死后大鼠循环血单个核细胞可促进MSCs迁移,其机制在一定程度上可能与单个核细胞分泌TNF-α增强MSCs粘附分子VCAM-1的表达有关。⑵在实验模型内,大鼠循环血单个核细胞分泌的生物因子不会影响迁移至中室与心肌细胞接触的MSCs向心肌样细胞分化。