孕期边缘型VA缺乏对大鼠海马突触可塑性钙信号通路的影响及可能机制

摘要

维生素A（Vitamin A，VA）是人体必需的重要微量营养素，维生素A缺乏（vitamin A deficiency，VAD）在世界范围内广泛存在，尽管目前国内外对VA营养状况越来越重视，但VAD，尤其是容易被人们忽视的可疑亚临床VAD或边缘型VAD仍然广泛存在，而孕妇和儿童又是VAD和可疑亚临床VAD的高危人群。近年来越来越多的研究发现VA营养与学习记忆及认知功能等有密切联系。本课题组前期研究发现从怀孕开始的边缘型维生素A缺乏（marginal Vitamin A deficient group，MVAD）仔鼠，其成年期学习记忆功能明显受损，电刺激诱发海马CA1区长时程增强（long-term potentiation，LTP）水平降低，且强刺激后MVAD组钙离子浓度明显低于VAN组。
　　 海马是与学习记忆，尤其空间学习记忆功能密切相关的重要部位，LTP是突触可塑性的神经电生理基础，Ca+内流入突触后膜是LTP诱发的起始信号。
　　 已有的研究证实与Ca2+内流入突触后膜相关的神经元膜受体除N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）外，还包括a-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic，AMPAR）受体、酪氨酸激酶B受体（tyrosine kinase B receptor，TrkBR）及代谢型谷氨酸受体（metabotropic glutamate receptor，mGluR）等。本课题组前期研究发现，孕期MVAD的仔鼠其海马组织中视黄酸核受体alpha（RARα）及NMDAR、CaM激酶Ⅱ、CBP、Arc等钙离子依赖性突触可塑性信号分子的表达均出现降低，同时，前期研究还发现，NMDAR1（NR1）与RARα在海马中存在共定位表达，提示孕期MVAD可能通过视黄酸（retinoicacid，RA）-RARα依赖的信号途径损害大鼠海马中突触可塑性钙信号途径相关分子的表达，并影响钙离子内流，最终损害LTP。
　　 目的：进一步探讨孕期MVAD对突触可塑性相关钙信号途径中AMPAR、TrKBR、mGluR的影响，以及VA在体内的活性代谢产物全反式视黄酸（all-trans retinoic acid，ATRA）对上述受体在神经元中表达的影响。最后，从电生理角度，探讨ATRA对神经元钙离子浓度调节作用、ATRA作用于不同孕期来源的神经元后，神经细胞内钙离子浓度的变化以及ATRA导致神经元胞内钙离子变化可能机制。
　　 方法：本课题构建MVAD孕鼠及雌性幼鼠模型，随机分为2组：（1）正常对照组（VAN组）：母鼠8只，给予维生素A充足饲料（含视黄醇6500IU/kg），生后24h及1周处死；（2）边缘型维生素A缺乏组：母鼠8只，给予维生素A部分缺乏饲料（VAD饲料，含视黄醇400 IU/kg），生后24h及1周处死；建立孕期MVAD大鼠模型，采用HPLC测定母鼠、新生大鼠及1周龄大鼠血清中VA浓度，RT-PCR测定海马组织中RARs及NMDAR、AMPAR、TrkBR、mGluR mRNA的含量，Western blot测定RARs及NR1蛋白的水平，以探讨孕期VA营养对仔鼠海马中视黄酸核受体及突触可塑性钙离子信号途径相关膜受体的表达调节作用；同时，采用原代无血清神经元培养方法，建立不同VA营养来源神经元细胞模型，分为ATRA处理组及Control组，免疫荧光技术鉴定神经元细胞纯度，并应用该方法对神经元中RARs、NR1表达定位。RT-PCR测定海马组织中RARs及NMDAR、AMPAR、TrkBR、mGluR mRNA的含量，Western blot测定RARs及NR1蛋白的水平，以进一步了解VA营养对突触可塑性钙信号途径的调节是否是通过ATRA-RARα信号途径依赖性。最后，探讨孕期MVAD对突触可塑性钙信号途径中钙离子内流的影响，采用多种分组方法以探讨ATRA对神经元钙离子浓度的影响机制：1）不同浓度的ATRA处理组：0.5μM、1μM、5μM、10μM、20μM；2）ATRA作用时间分组：8min、30min、1h、24h；3）建立不同孕期VA营养神经元细胞模型：MVAD及VAN，观察神经元细胞内钙离子浓度的变化；4）依据神经元在体外不同生长时间点分组：1d、4d、8d、11d、15d，了解ATRA对神经元胞内钙离子浓度的调节与神经元的体外生长时间关系；5）通过细胞外液无钙与含钙分组，以探讨ATRA导致神经元钙离子浓度升高的方式：外钙内流或是胞内钙释放；6）分别采用RARα、AMPAR及NMDAR拮抗剂预处理神经元1h后，再以ATRA作用神经元，探讨这些受体在ATRA导致神经元胞内钙离子浓度升高中作用。
　　 结果：1）MVAD组海马组织中RARα、NR1、AMPR1、TrkBR mRNA的表达明显低于VAN组，RARα及NR1在海马中蛋白水平也明显低于VAN组，而视黄酸核受体β（RARp）的表达很低；2）原代培养海马神经元中神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolage，NSE）阳性细胞达到90％以上，且MVAD组与VAN组比较，两组NSE阳性细胞率无明显差异；3）原代培养8天海马神经元中RARα及NR1明显表达，RARα主要表达于胞浆及突起位置，少部分在细胞核，NR1则分布于胞浆及突起位置，而RARβ则表达很低；4）ATRA处理后，原代神经元中，RARα及NR1蛋白表达上调，AMPAR及TrkBR mRNA表达上调；5）ATRA处理后，原代海马神经元中钙离子浓度明显升高，不同浓度ATRA处理后，各组钙离子浓度变化有明显区别；ATRA作用不同时间后，神经元钙离子浓度变化不同；在ATRA作用于体外不同生长时间的神经元后，其钙离子浓度变化有显著差异；进一步研究显示ATRA及NMDA.分别作用于不同孕期VA营养神经元时，MAVD组钙离子升高值明显低于VAN组；6）RARα选择性拮抗剂、NMDAR拮抗剂MK801及AMPAR拮抗剂NBQX提前作用神经元后，再以ATRA处理时，钙离子浓度低于ATRA单独作用组。
　　 结论：1.孕期MVAD降低新生大鼠及1周龄大鼠海马组织中RARα及NR1mRNA及蛋白水平的表达，ATRA能升高神经元中RARα及NR1mRNA及蛋白水平表达，提示VA能通过RA-RARα信号通路调节NMDAR表达，电生理结果提示孕期MVAD抑制ATRA及NMDA诱导的神经元钙离子内流，表明孕期MVAD能通过RA-RARα信号通路调节NMDAR表达，进而影响神经元钙离子内流，这可能是VA营养影响突触可塑性钙信号通路的重要机制之一。
　　 2.孕期MVAD对新生大鼠及1周龄大鼠海马组织AMPAR、TrkBRmRNA表达降低，ATRA能升高神经元中AMPAR及TrkBRmRNA的表达，提示VA能通过RA信号通路调节上述受体表达，这可能是VA营养影响突触可塑性钙信号通路的另一重要机制。
　　 3.ATRA会导致神经元中钙离子浓度的内流，而RARα选择性拮抗剂、NMDAR及AMPAR的拮抗剂能分别部分阻断ATRA的作用，提示RARα、NMDAR及AMPAR在ATRA导致神经元胞内钙离子浓度中发挥重要作用。
　　 4.ATRA导致神经元中钙离子浓度的内流，其作用与ATRA浓度及ATRA作用时间相关，同时，体外不同生长时间的神经元，ATRA作用后，胞内钙离子浓度升高不同，可能与体外不同生长时间点神经元，成熟度不同，相关的受体表达不一致有关。