不可逆性电穿孔致HeLa细胞程序性死亡的实验研究

摘要

不可逆性电穿孔(irreversible elechoporation，IRE)是指细胞在一定参数的脉冲电场(pulsed electric fields，PEFs)作用下，脂质双分子层结构的胞膜内磷脂分子发生重排、膜上不可恢复的亲水通道形成、细胞膜的通透性增加。通过这些细胞膜上永久性的亲水通道，胞内物质外泄以及大量胞外的水分、金属离子和蛋白大分子内流，最终致使细胞肿胀、破裂而死亡。随着电脉冲功率技术的不断进步，脉冲电场不可逆性电穿孔在恶性肿瘤治疗领域越来越为广大学者所重视。
　　既往的研究认为，脉冲电场不可逆性电穿孔消融肿瘤组织和细胞的主要作用机理是，高能量强度的脉冲电场使肿瘤细胞膜大量持续性穿孔形成，细胞膜失去完整性，最终发生坏死，是一种即刻的杀伤效应。然而近来的一些针对动物在体组织的实验发现，在不可逆性电穿孔消融作用后，除了凝固性坏死外还存在细胞凋亡的痕迹。但是这种凋亡的发生和脉冲电场参数之间有怎样的联系还不明确。凋亡是细胞程序性死亡的主要方式之一，凋亡调节异常则是多种恶性肿瘤发生发展中重要的一个环节。与坏死相比较，在体肿瘤组织凋亡时凋亡细胞被吞噬细胞清除，不会引发机体明显的炎症反应，发生感染、出血的风险随之降低。因为恶性细胞的侵袭特性，恶性肿瘤手术治疗一般都要遵循“超范围切除”的原则；同样，在不可逆性电穿孔治疗恶性肿瘤时也要做到“超范围消融”。这就意味着瘤体周边更多的正常组织也要受累，治疗以后会在机体内形成更大的坏死组织块。因此，在不可逆性电穿孔消融恶性肿瘤时，如果能够通过调节适当的脉冲电场参数组合使更多的肿瘤细胞通过凋亡效应诱导而被杀灭，对提高治疗效率和治疗的安全性都具有重要的意义。
　　宫颈癌是女性生殖系统最高发的恶性肿瘤，晚期病变预后较差。早期宫颈癌虽然通过手术治疗能够达到近乎治愈的水平，但是对于年轻患者往往意味着失去生育的能力。随着细胞学筛查技术、HPV病毒检测手段以及组织学检查技术的发展，越来越多的宫颈癌病例在病变早期就能够被发现和确诊。同时宫颈的特殊解剖结构，使得宫颈可以通过简单的手段充分暴露，有利于电极针的布阵，因此不可逆性电穿孔在宫颈癌治疗中有着较好的应用前景。
　　本研究将脉冲电场不可逆性电穿孔技术作用于人宫颈癌HeLa细胞，通过电场参数变化，探讨HeLa细胞效应结果与脉冲电场之间的关系。运用CCK-8(cell counting kit-8)检测、流式细胞术(flow cytometry，FCM)、透射电镜、激光共聚焦显微镜、Western blot、RT-PCR(reversetranscriptase polymerase chain reaction)等方法检测细胞凋亡以及凋亡相关蛋白和基因表达。与此同时，还初步探讨了不可逆性电穿孔作用于HeLa细胞后的胞内处理效应，以及另一种程序性死亡(programmedcell death，PCD)--自噬的发生情况。
　　第一部分，不可逆性电穿孔对HeLa细胞抑制作用的研究
　　第一节，脉冲电场作用下HeLa细胞膜电穿孔与凋亡和坏死的关系
　　目的：探讨脉冲电场不可逆性电穿孔处理HeLa细胞时，发生细胞膜电穿孔现象、细胞凋亡、细胞坏死与脉冲电场参数的关系。
　　方法：采用固定脉宽100μs、频率1Hz、脉冲数8个，电场强度由250V/cm逐级升至2500V/cm的脉冲电场处理HeLa细胞。利用碘化丙啶(propidium iodide，PI)示踪、流式细胞术检测研究HeLa细胞膜发生穿孔的阈值电场强度剂量；CCK-8法检测脉冲电场抑制HeLa细胞活力的量效关系；Anmexin V kit染色、流式细胞术检测各组细胞的凋亡与坏死。
　　结果：HeLa细胞膜发生可逆性穿孔的阈值场强为750V/cm；不可逆性电穿孔的阈值场强约为1000V/cm～1250V/cm；发生凋亡的阈值电压约在1000V/cm～1250V/cm之间；坏死的阈值在1500V/cm～1750V/cm之间。
　　结论：不可逆性电穿孔抑制HeLa细胞的作用中，细胞凋亡也发挥着重要作用，并且存在一个“凋亡窗口参数”。导致HeLa细胞凋亡与坏死的阈值场强非常接近，而且其电场参数范围相互重叠。
　　第二节，不同参数组合脉冲电场抑制HeLa细胞的差异
　　目的：研究通过调整脉冲个数使低电场强度脉冲和高场强脉冲达到对HeLa相同的抑制率时，HeLa细胞死亡方式之间存在的差异。
　　方法：根据前面的实验结果，选择1000V/cm和2250V/cm分别作为低场强和高场强的代表参数，CCK-8法检测不同脉冲数的电场处理后HeLa细胞存活率。分别选取能够有效抑制HeLa细胞活性且抑制率相近的高场强和低场强参数组合脉冲电场作用于HeLa细胞，发挥不可逆性电穿孔效应。作用后即刻在相差显微镜下观察细胞形态，并利用CCK-8法检测细胞活性、绘制时间一效应曲线。
　　结果：1000V/cm×5组脉冲和2250V/cm×2组脉冲的参数作用后24h，对HeLa细胞抑制率都约为94％，两组之间差异无统计学意义。但是低场强处理后即刻，细胞形态基本正常，而高场强处理后镜下可见大量细胞残骸聚集成团。时间.效应曲线结果显示2250V/cm×2组脉冲处理后HeLa细胞活性迅速下降，作用后4小时达到最大效应；1000V/cm×5组脉冲作用后，HeLa细胞活性呈现逐渐下降的趋势，作用后6-8小时之间下降最为明显，12小时达最大效应。
　　结论：在不可逆性电穿孔对HeLa细胞抑制率相同的前提下，高场强脉冲参数组合对HeLa细胞抑制表现为即刻效应；低场强脉冲呈现出致使细胞逐渐死亡的趋势。
　　第二部分，不可逆性电穿孔致HeLa细胞程序性死亡的研究
　　第一节，IRE致HeLa细胞凋亡的实验研究
　　目的：探讨高场强和低场强参数脉冲电场IRE作用于HeLa细胞，细胞凋亡的发生以及凋亡相关因子的改变。
　　方法：分别用高场强(2250V/cm，2组脉冲)和低场强(1000V/cm，5组脉冲)参数脉冲电场IRE处理HeLa细胞。6小时后，Annexin V kit染色、流式细胞术检测HeLa细胞凋亡与坏死。收集HeLa细胞标本，透射电镜观察细胞超微结构的改变。Western blot检测凋亡相关酶caspase-3、caspase-8活性蛋白；RT-PCR检测Bax，Bcl-2 mRNA转录水平。
　　结果：流式细胞仪检测显示，处理后6小时低场强组HeLa细胞表现为凋亡、坏死、存活三种状态同时存在，而高场强组几乎全部坏死。透射电镜观察发现低场强组有大量细胞呈现典型的凋亡形态，高场强组细胞主要表现为胞膜缺失、细胞融合、细胞碎片形成。Western blot结果提示低场强作用后HeLa细胞caspase-3、casloase-8活性片段蛋白水平升高；RT-PCR检测结果发现低场强参数IRE处理后的HeLa细胞Bax转录水平升高而Bcl-2转录水平显著降低。
　　结论：低场强脉冲电场IRE作用于HeLa细胞可以部分诱导HeLa细胞凋亡，在此过程中CaSpase-3和caspase-8被活化。Bax和Bcl-2之间比例失衡也参与其中，发挥一定作用。
　　第二节，IRE诱导HeLa细胞自噬作用的实验研究
　　目的：探讨低场强参数的IRE作用对HeLa细胞溶酶体以及溶酶体相关酶活性的影响，和HeLa细胞内自噬相关因子表达水平变化。
　　方法：低场强IRE前后，溶酶体荧光探针lyso-Tracher Red标记溶酶体，激光共聚焦显微镜观察比较不可逆性电穿孔处理前后溶酶体改变；Western blot检测细胞微管相关蛋白1轻链3(Microtubule-associatedprotein1 light chain3，LC3)表达；RT-PCR检测组织蛋白酶B(CathepsinB，CTSB)和Beclin-1转录水平变化；利用特异性底物裂解法检测CTSB活性。
　　结果：不可逆性电穿孔处理后HeLa细胞内溶酶体荧光探针的荧光强度显著降低。Western blot检测结果提示LC3当中LC3-Ⅱ相对于LC3-Ⅰ表达比例显著升高。Beclin-1 mRNA转录水平较对照组升高，CTSB mRNA水平与处理前无明显差异，但是其蛋白酶活性明显增强。
　　结论：低场强参数IRE处理HeLa细胞后，胞浆内溶酶体结构发生改变，CTSB活性增强。HeLa细胞自噬功能被激活，在HeLa细胞程序性死亡中发挥着一定作用。
　　第三部分，不可逆性电穿孔对HeLa细胞胞内效应的研究
　　目的：以内质网和线粒体为对象，研究低场强参数IRE作用对HeLa细胞的胞内处理效应，以探讨其致HeLa细胞程序性死亡的机制。
　　方法：利用透射电镜观察IRE作用后HeLa细胞内质网和线粒体超微结构变化。钙离子Fluo3-AM探针标记，流式细胞术及激光共聚焦显微镜检测细胞内钙离子释放；罗丹明123(Rhodamine123，Rh123)荧光探针染色标记，激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位改变。Westernblot检测IRE后HeLa细胞内GRP78和Cyt C蛋白水平；RT-PCR检测GADD153 mRNA转录水平。
　　结果：IRE作用后，HeLa细胞超微结构显示内质网严重肿胀而线粒体表现出轻度的嵴型肿胀。线粒体膜电位在IRE作用后即刻无明显改变，作用后2小时显著下降；HeLa细胞内钙离子浓度在IRE处理后较对照组显著升高。HeLa细胞内GRP78和Cyt C蛋白水平以及GADD153 mRNA表达在IRE作用后显著升高，但是Cyt C水平达峰值时间晚于GRP78。
　　结论：IRE除直接作用于细胞膜外还同时存在胞内处理效应，对HeLa细胞内质网以及线粒体结构和功能有显著影响。IRE会引起内质网应激及胞内Ca2+释放；线粒体膜电位下降以及Cyt C释放。IRE的胞内效应可能是致HeLa细胞程序性死亡的重要原因。