腺病毒介导ZBTB7B siRNA对Jurkat细胞CD4、CD8及P14ARF表达的影响研究

摘要

目的：构建携带靶向锌指结构转录调节因子小干扰RNA(Zincfinger and BTB domain-containing protein7B siRNA，ZBTB7B siRNA)的重组腺病毒质粒，采用腺病毒介导ZBTB7B siRNA沉默Jurkat细胞中ZBTB7B的表达，检测Jurkat细胞中ZBTB7B及P14ARF基因的表达及细胞表面分子CD4和CD8的表达。
　　方法：采用定向克隆的方法将靶向ZBTB7B siRNA插入到穿梭质粒pSES-HUS，酶切及基因测序鉴定正确后命名为pSES-ZBTB7B si；采用同源重组方法将pSES-ZBTB7B si与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1连接，构建重组腺病毒质粒pAd5-ZBTB7B si；酶切鉴定pAd5-ZBTB7Bsi，以脂质体介导法将其导入HEK293包装细胞，乒乓感染法收集高滴度的重组腺病毒Ad5-ZBTB7B si；将重组腺病毒Ad5-ZBTB7B si感染Jurkat细胞，实验分为3组：实验组(Jurkat/Ad5-ZBTB7B si)、空载体组(Jurkat/Ad5)、空白对照组(Jurkat)，Real-time PCR法分别检测Jurkat细胞中ZBTB7B mRNA及P14ARFmRNA的表达；流式细胞术检测Jurkat细胞表面分子CD4和CD8的表达。
　　结果：①酶切及基因测序证实重组腺病毒质粒pad5-ZBTB7B si构建成功。②荧光显微镜证实重组腺病毒Ad5-ZBTB7B si成功导入HEK293包装细胞。③获得高滴度重组腺病毒Ad5-ZBTB7B si。④实验组ZBTB7B mRNA表达量N(1.403±0.390)×10-3，较空载体组及空白对照组明显降低，差异有统计学意义(p=0.000)。⑤实验组P14APFmRNA的表达为(7.294±1.228)×10-3，与空载体组及空白对照组比较明显升高，差异有统计学意义(p=0.034)。⑥实验组CD4及CD8的表达分别为(32.45±9.34)％、(49.34±12.45)％，与空载体组及及空白对照组比较差异无统计学意义(p>0.05)。
　　结论：①成功构建及收集高滴度重组腺病毒Ad5-ZBTB7Bsi并顺利感染Jukat细胞。②携带靶向ZBTB7B siRNA的重组腺病毒Ad5-ZBTB7Bsi能明显抑制Jukat细胞中ZBTB7B mRNA的表达。③随着ZBTB7B mRNA表达的下降，Jurkat细胞中P14ARFmRNA的表达显著升高，证明ZBTB7B与P14ARF的表达密切相关。④随着ZBTB7BmRNA的表达的下降，Jurkat细胞表面分子CD4/CD8的表达无显著改变，证明Jurkat细胞中CD4/CD8的表达与ZBTB7B的表达不相关。