shRNA沉默RPS14基因对MDS细胞株SKM-1细胞增殖的影响

摘要

目的：骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic syndrome，MDS)是一组起源于多能造血干/祖细胞的异质性恶性血液疾病，以高风险向急性白血病转化为其特征，故又俗称白血病前期(Preleukemia，PL)。目前本病的发病机制尚未阐明，缺乏有效的治疗手段。因此，探索MDS的分子发病机制，寻找MDS的有效治疗手段具有重要意义。MDS最常见的染色体缺失是5号染色体长臂的缺失，所有伴有del(5q)的MDS患者染色体缺失区域均含有5q31-5q32区带，称为共缺失区域(common delete region，CDR)。对CDR的基因测序研究未发现显性突变，均表现为基因表达量的下降。其中，位于该区域的RPS14基因，是单倍剂量减少的抑癌基因，近年研究表明，伴有del(5q)的MDS患者体内RPS14基因表达水平下降。而对于5号染色体表型正常的MDS患者体内RPS14基因表达变化是否也具有同样的意义目前尚未有研究报道。因此，研究RPS14在MDS发生发展中的作用具有重要意义。本实验通过构建RPS14基因RNAi慢病毒载体(Lentiviral Vector，LV)，观察该基因在人MDS细胞株SKM-1细胞中的表达，并将构建成功的重组慢病毒载体RPS14-shRNA转染人MDS细胞株SKM-1细胞，使目的基因在靶细胞内表达沉默。以便深入研究RPS14基因对MDS细胞内生物学行为的影响。通过细胞增殖率变化等方法观察RPS14基因表达沉默后对SKM-1细胞增殖的影响。
　　方法：
　　1、RPS14基因RNAi慢病毒载体RPS14-shRNA的构建及鉴定：选用新型慢病毒载体pGC-SIL-GFP，首先设计合成RPS14互补脱氧核糖核酸(Complementary deoxynucleic acid，cDNA)的PCR产物与线性化慢病毒载体相连接，产物经测序鉴定确认，与包装质粒共转染293T细胞，产生重组慢病毒载体RPS14-shRNA，逐孔稀释法测定病毒滴度；采用流式细胞仪检测转染效率，Western blot检测转染前后目的细胞内RPS14蛋白的表达变化。
　　2、重组慢病毒载体RPS14-shRNA转染SKM-1细胞后对其增殖影响的研究：将重组慢病毒载体RPS14-shRNA转染SKM-1细胞(转染组)，同时设立未转染组(SKM-1)、空载体转染组，应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定各组细胞的光密度值(Optical density，OD)。
　　结果：
　　1、本实验成功构建了重组慢病毒载体RPS14-shRNA，滴度达2.0×102TU/ml，构建的慢病毒载体能够高效率的转染SKM-1细胞，100感染复数(Multiplicity of infection，MOI)的重组慢病毒载体对SKM-1细胞的转染效率约为58.26％，Western blot检测显示转染后靶细胞RPS14蛋白的表达水平明显低于转染前，实验组与对照组比较具有统计学意义(P<0.01)。
　　2、重组慢病毒载体RPS14-shRNA转染SKM-1细胞后抑制其增殖：转染48h、72h、96h，收集各组细胞，MTT法检测各组细胞的OD值，转染重组慢病毒载体后对SKM-1细胞的生长有抑制作用，与空载体转染组相比具有统计学意义(P<0.05)。
　　结论：
　　1、慢病毒载体可以高效率的转染血液肿瘤细胞，对血液肿瘤的分子治疗具有重要的临床应用价值。
　　2、对于5号染色体表型正常的MDS细胞株SKM-1细胞RPS14基因表达沉默可抑制其增值。
　　3、本研究结果表明RPS14基因在MDS的发生发展中起着重要作用。