OrexinA对大鼠内侧内嗅皮层和前额叶皮层深层神经元的作用及其机制研究

摘要

第一部分，OrexinA对大鼠内侧内嗅皮层深层神经元的调节作用及其离子机制研究
　　目的：内嗅皮层深层神经元在学习记忆的巩固以及空间认知功能中发挥重要作用。本文主要观察促觉醒肽OrexinA对大鼠内嗅皮层深层神经元的调节作用，并探讨其生理功能和离子机制。
　　方法：采用全细胞膜片钳记录技术，选择内侧内嗅皮层(MEC，medial entorhinal cortex)深层神经元为研究对象，通过加入TTX(1μM)，CNQX(10μM)和AP-V(50μM)阻断突触前作用，重点研究神经元突触后的离子机制。观察1)加入促觉醒肽OrexinA(100 nM)后神经元的兴奋性变化及全细胞钾电流的变化；2)加入瞬时钾抑制剂4-AP(5mM)分离出持续钾电流，再加入OrexinA后持续钾电流的变化；3)将细胞外液替换为无钙人工脑脊液，并加入OrexinA后神经元电位的变化；4)灌流Orexin受体1阻断剂SB334867(5μM)后，OrexinA是否还能引发神经元兴奋。
　　结果：本实验结果如下：
　　1.OrexinA对MEC深层神经元兴奋比例为38.7％，不兴奋比例为54.8％，抑制比例为6.5％
　　在被测的93个内嗅皮层深层神经元中，36个神经元对OrexinA有明显的兴奋性反应，主要表现为膜电位的去极化伴随动作电位的大量发放，其兴奋细胞所占比例为38.7％；对OrexinA无反应的神经元51个，所占比例为54.8％；6个神经元加入OrexinA后出现抑制效应，所占比例为6.5％。
　　2.OrexinA通过作用于MEC深层神经元突触后Orexin受体1发挥兴奋神经元作用
　　选取对OrexinA有兴奋性反应的细胞，灌流Orexin受体1阻断剂SB33486730min后，再次加入同剂量OrexinA，膜电位的去极化水平(4.066±1.08mV，n=5)显著低于对照组(20.1±8.4mV，n=15，p<0.01)。
　　3.OrexinA对神经元的兴奋性作用是通过抑制全细胞钾电流中的持续钾电流实现的
　　在TTX，AP-V，CNQX阻断突触前作用和电压钳模式下，给予细胞-60mV～+40 mV的步阶电压刺激，步阶幅值为20 mV，持续时间500 ms。然后加入OrexinA，观察到全细胞钾电流明显减小，差异具有显著性(p<0.05，n=6)。使用瞬时钾电流阻断剂TEA将持续钾电流分离出来，再加入OrexinA后，持续钾电流明显减小，说明OrexinA对神经元的兴奋性作用是通过抑制全细胞钾电流中的持续钾电流来实现的(p<0.05，n=6)。
　　4.OrexinA对神经元的兴奋性作用需要细胞外钙离子内流
　　将细胞外的正常人工脑脊液(ACSF)替换为无钙的人工脑脊液(Ca2+-free ACSF)，加入OrexinA后，神经元膜电位依然能产生去极化反应(13.18±1.52 mV，n=7)，但较之正常情况下(20.11±8.38 mV，n=15)膜电位去极化幅度明显减小(p<0.05)。说明钙离子可能部分参与了OrexinA对神经元的兴奋性效应。
　　结论：内侧内嗅皮层深层神经元对促觉醒肽OrexinA的反应具有多样性，其中主要以对OrexinA不敏感神经元为主，其次是对OrexinA起兴奋反应的神经元，起抑制反应神经元极少。OrexinA兴奋该区域神经元主要是通过激活Orexin受体1，然后经抑制全细胞钾电流中的持续钾电流和诱发钙离子内流共同实现的。
　　第二部分，OrexinA对前额叶皮层PL区第Ⅴ层锥体神经元的调节机制
　　目的：观察促醒肽OrexinA是否通过p38-MAPK途径抑制HCN通道，从而兴奋前额叶皮层PL区第Ⅴ层锥体神经元。
　　方法：采用全细胞膜片钳技术，以前额叶皮层PL区第Ⅴ层锥体神经元为研究对象，记录对OrexinA起兴奋反应神经元的Ih电流，并观察OrexinA对兴奋神经元的HCN通道的影响，然后分别加入p38-MAPK阻断剂SB203580(10μM)和激活剂Anisomycin(20μM)，观察OrexinA对HCN通道的影响。
　　结果：实验结果如下：
　　1.OrexinA可以通过抑制HCN通道，兴奋前额叶皮层PL区第Ⅴ层锥体神经元
　　在加入OrexinA(400nM)的10个神经元中，其中6个神经元有明显兴奋性效应。在有兴奋性反应的神经元中，均能检测到OrexinA作用后HCN通道开放所诱发的Ih电流(67.45±10.16 pA)，与对照组(153.2±25.26 pA)相比明显减小(p<0.01，n=6)。
　　2.抑制p38-MAPK可以使HCN通道开放所诱发的Ih电流减小，并增强神经元兴奋性
　　在灌流p38-MAPK阻断剂SB203580(10μM)的10个神经元中，有7个神经元均能观察到动作电位发放明显增加，且记录到的Ih电流幅度(82.6±9.34 pA)和“sag”值(23.31±1.32 mV)与加阻断剂SB203580前(Ih幅度：162.34±7.25 pA；sag值：27.24±0.29 mV)相比均明显减小(p<0.05，n=4)。
　　3.OrexinA对HCN通道的抑制作用可能没有涉及p38-MAPK途径
　　选择对OrexinA有兴奋性反应的细胞，首先观察加入OrexinA后Ih电流的变化，将其作为对照组。灌流p38-MAPK激动剂Anisomycin20min后，再加入OrexinA，Ih电流幅度(72.4±1.25 pA)与对照组(73.8±0.49 pA)相比无明显变化(p>0.05，n=5)。
　　结论：OrexinA可以通过抑制HCN通道，兴奋前额叶皮层PL区第Ⅴ层锥体神经元。p38-MAPK参与了对该区域神经元HCN通道的调节，但OrexinA并没有通过该信号通路调节HCN通道，提示OrexinA很可能是直接通过PLC-PKC途径作用于HCN通道。此外，p38-MAPK对HCN通道的直接调控作用提示：可能还存在其它信号分子能够协同OrexinA共同调节HCN通道，发挥兴奋神经元的效应，从而增强前额叶皮层工作记忆和认知等生理功能。