氟中毒肾损伤时STC1、UCP2的表达与作用及高钙干预对其影响的机制研究

摘要

长时间、过量的氟摄入会导致机体组织和脏器的损伤，并特征性的引起氟斑牙、骨关节畸形、骨质疏松、骨关节硬化。该类疾病均由氟中毒导致，并统称为地氟病。地氟病是一种覆盖各大洲，影响数千万人的地球化学性疾病。近15年来，氟中毒对非骨相系统的影响正逐渐成为学界的研究热点，其中又因为肾脏是机体排氟的最主要脏器和其本身就是氟中毒的靶器官，而使肾脏成为了非骨相系统研究中的重点。线粒体是氟离子攻击细胞的核心靶点，肾脏作为富含线粒体的脏器，已在前人的大量研究中证实了氟中毒能使肾小管上皮细胞中线粒体的结构，功能活性受到严重影响，并与染氟剂量存在剂量-程度相关性，但是，氟中毒影响肾小管上皮细胞线粒体的毒理机制尚不明确，因此，本课题选择从线粒体层面对氟中毒肾损伤进行相关机制的研究。
　　斯钙素蛋白1(Stanniocalcm1，STC1)是一种调节细胞钙离子平衡的糖蛋白激素，在人体的许多脏器都有表达，高表达于肾脏、前列腺、子宫和甲状腺。STC1主要通过自分泌和旁分泌起作用，并作用于细胞的线粒体，调节钙及磷酸盐的代谢。近年来STC1的其他功能逐渐被发现，相关研究显示，STC1与损伤修复、细胞信号转导、血管再生、类固醇生成、肌肉和骨的生长、肿瘤等相关。最新的研究显示，STC1可以通过调节钙离子的含量致使细胞第二信使功能减弱，并通过增高解偶联蛋白2(UCP2)的表达来抑制线粒体膜电位降低和减少超氧化物的产量，这与细胞ATP的生成、NADH和FADH2平衡、ROS产量等息息相关。UCP2定位于线粒体内膜，是一种调控线粒体内外膜电化学梯度的解偶联蛋白，占线粒体膜蛋白含量的0.01-0.1％，在正常情况下，UCP2并没有介导线粒体膜质子漏，亦未对线粒体内外膜的电位差产生过多影响。但在细胞受到攻击或刺激时，特别是对能带来氧化应激、脂质过氧化损伤的刺激，可促使UCP2介导线粒体内外膜间发生质子漏，从而降低线粒体内外膜的膜电位差，使ROS产量减少、超氧化物产量减少等，并以之拮抗相关损伤给细胞、组织带来的损害。UCP2介导线粒体膜电位差改变要借助于[Ca2+]及[Ca2+]相关通道蛋白才能完成，且细胞钙含量的改变也能促使UCP2的表达发生改变，近年来的研究发现，钙离子与UCP2的关系不仅在机体抵御外界刺激时才能发生，而且在各种肿瘤的发生、发展过程中，UCP2可以作为一种肿瘤标志物，通过调节钙离子含量及钙离子相关通道影响肿瘤细胞的各种异质化功能。
　　本课题从线粒体层面对氟中毒肾损伤的分子机制进行研究，紧扣目前氟中毒肾损伤研究的薄弱点；以肾小管上皮细胞线粒体解偶联蛋白2和斯钙素蛋白1作为研究对象，以钙离子作为干扰条件，探讨氟中毒肾损伤时UCP2、STC1是否参与了氟中毒肾损伤过程，是否在参与过程中受到钙离子的影响，初步研究UCP2、STC1在氟中毒肾损伤机制中的作用；本研究先进行动物实验，观察氟中毒大鼠肾脏中UCP2、STC1的改变，线粒体解偶联功能的改变和氧化应激指标的改变，以及这些改变与肾组织中[Ca2+]含量的关系，再给予大鼠高钙饮食，观察UCP2、STC1表达出现的变化，高钙与该变化的关系；构建重组UCP2真核表达质粒质粒，使肾小管上皮细胞(HK2)高表达UCP2，再以氯化钙侵染细胞培养基，研究不同剂量氟化钠干扰高表达UCP2的肾小管上皮细胞时，细胞生长情况、线粒体解偶联相关指标的变化，此类变化被高钙环境干预后出现的改变，以及UCP2、STC1、[Ca2+]在氟中毒肾损伤中的关系；该实验从亚细胞器水平对氟中毒肾损伤机制进行研究，选择了与[Ca2+]、氧化应激密切相关的UCP2、STC1作为研究靶点，实验设计符合逻辑，该实验的结果可为以后从线粒体水平研究氟中毒肾损伤的分子机制提供理论和实验基础。
　　第一部分，氟中毒大鼠肾脏STC1、UCP2的表达及肾细胞内[Ca2+]含量的变化
　　目的：构建符合实验需要的氟中毒模型，检测UCP2、STC1及钙、磷离子在氟中毒大鼠肾损伤中的变化，探讨UCP2、STC1在氟中毒肾损伤机制中的作用及与钙离子的关系。
　　方法：24只雄性SD大鼠按体重平均分为4组：对照组、低氟组、中氟组、高氟组；对照组采用生理盐水注射，实验组按体重比分别给予5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg的NAF腹腔注射，每48小时注射1次，蒸馏水及常规鼠饵自由饲食；建模16周后，取左肾包埋固定，行免疫组化检测UCP2、STC1的蛋白定位及表达，右肾组织50mg提取总RNA，采用RT-PCR技术分析UCP2、STC1基因表达水平，并荧光探针检测肾细胞内[Ca2+]i水平。
　　结果：免疫组化提示UCP2高表达于肾脏皮髓交界的近曲小管，STC1也主要定位于近曲小管，但有少量表达与髓质的远曲小管。免疫组化及RT-PCR结果提示三种染氟大鼠的UCP2、STC1表达量均显著高于对照组，并随着染氟剂量的增大而显著增高(两两比较，P<0.05)；各实验组大鼠肾细胞内钙离子含量显著高于对照组，且随着染氟剂量的增大而增高(两两比较，P<0.05)；
　　结论：氟中毒大鼠肾损伤中，UCP2、STC1可能参与了损伤机制，而该损伤机制可能是由于钙磷离子代谢失衡造成。
　　第二部分，高钙干预下氟中毒大鼠肾脏STC1、UCP2的表达及肾细胞内[Ca2+]含量的变化
　　目的：观察UCP2、STC1在氟中毒大鼠肾脏中的变化，及高钙对氟中毒的拮抗作用。探讨UCP2、STC1与高钙的相互联系及在氟中毒肾损伤中的作用。
　　方法：42只雄性SD大鼠按体重分为对照组、低氟加钙组、中氟加钙组、高氟加钙组；对照组采用生理盐水注射，低、中、高氟加钙组同样按体重比分别给予5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg的氟化钠腹腔注射，每48小时注射1次，给予高钙饮食。建模16周后行免疫组化及RT-PCR检测UCP2、STC1的定位及表达，荧光探针检测肾细胞内[Ca2+]i水平，并检测肾组织脂质过氧化产物的活性。
　　结果：印证了第一节中UCP2、STC1主要定位于肾脏皮髓交界的近曲小管，很少量表达于肾髓质的远曲小管；与对照组相比较，UCP2、STC1在各染氟加钙组的的表达随着染氟浓度的增加而增高，差异有显著性(P<0.05)。横向对比同剂量单纯染氟组，UCP2在高氟加钙组的表达显著高于高氟组(P<0.05)，UCP2在低、中氟加钙组对比低、中染氟组虽未出现显著性改变，但在表达上也呈现上升的趋势。STC1在各个染氟加钙组的表达与对应剂量的单纯染氟组均未出现显著性改变(P>0.05)，但在表达上也呈现上升的趋势；各实验组大鼠肾细胞[Ca2+]i水平显著高于对照组，且随着染氟剂量的增大而升高，高钙可抑制肾细胞内[Ca2+]i水平。
　　结论：氟中毒肾损伤时UCP2、STC1可反应性增高，高钙能拮抗氟中毒肾损伤作用，并促进UCP2、STC1的表达，且抑制肾细胞内[Ca2+]水平。UCP2、STC1可能参与了氟中毒大鼠肾损伤机制，且具体的参与过程可能与钙离子相关。
　　第三部分，氟中毒大鼠肾脏线粒体解偶联相关指标及氧自由基的变化
　　目的：检测染氟大鼠肾组织中线粒体解偶联相关指标及氧自由基的变化，并与UCP2的表达进行比较，观察UCP2的解偶联功能是否参与了氟中毒肾损伤机制。
　　方法：提取大鼠肾脏线粒体，检测线粒体呼吸功能；利用线粒体膜孔道开放可以使线粒体发生肿胀的原理，使用荧光分光光度计检测线粒体肿胀程度；利用罗丹明123可以在线粒体中迅速发生荧光淬灭的原理，使用荧光分光光度计检测检测氟中毒大鼠肾脏中线粒体的膜电位(△ψm)；利用来源于线粒体的未成对电子与氧结合生成的超氧阴离子可与四唑盐(NBT)反应，其生成物可以在激发波长为570nm时产生特征性吸收的原理，使用酶标仪检测线粒体超氧化物含量。
　　结果：与对照组相比，线粒体Ⅲ态呼吸率在低氟组出现了轻度回升，在中氟组又趋于下降，但在低、中氟组未见显著性差异(P>0.05)；在高氟组出现了显著性降低(P<0.05)：与对照组相比，Ⅲ态呼吸率在低氟加钙组出现了下降、在中氟加钙组亦出现下降，但差异均无显著性(P>0.05)，在高氟加钙组能在一定程度上提升呼吸率。Ⅳ态呼吸率在低、中染氟组出现了升高，在高氟组出现了降低，差异均无显著性(P>0.05)。钙对氟中毒大鼠肾脏中线粒体的Ⅳ态呼吸率产生一定程度的抑制作用，但差异不明显。线粒体呼吸控制率(RCR)随着染氟浓度的增高而逐渐减低，在高氟组出现了明显降低(P<0.05)，钙可以拮抗这种变化，虽在高氟加钙组仍然呈现显著性降低，但RCR数据出现了回升，在各染氟加钙组均出现了线粒体呼吸控制率的改善。
　　结论：氟中毒肾损伤时，线粒体解偶联相关指标线粒体膜电位、线粒体肿胀所反映的线粒体膜通道转运孔开放程度会发生显著性改变，提示解偶联功能可能参与到氟中毒肾损伤机制中；随着染氟浓度的增高，线粒体肿胀程度和氧自由基水平都会提高，高钙可以抑制以上的变化，实验结果印证了前人研究的氟中毒会造成线粒体损伤和氟中毒氧自由基损伤的机制，且高钙能拮抗氟中毒损伤的作用。
　　第四部分，高表达UCP2的氟中毒肾小管上皮细胞与STC1、线粒体解偶联功能的关系
　　目的：检测氟化钠对肾小管上皮细胞(HK2)生长的抑制作用，并检测UCP2、STC1、线粒体解偶联相关指标的表达，观察在细胞层面UCP2、STC1、线粒体解偶联相关指标是否也出现了改变，及相互之间的关系如何。通过使肾小管上皮细胞高表达UCP2，观察UCP2对氟中毒造成的肾小管上皮细胞(HK2)的损伤是否存在拮抗作用，并同样检测STC1的表达，线粒体解偶联相关指标的变化和细胞内钙离子含量，观测指标的变化，探讨UCP2、STC1、钙离子与氟中毒肾损伤的关系。
　　方法：构建含人UCP2基因片段的真核表达质粒，并转染HK2，给予正常的HK2和转染了UCP2的HK2培养基中侵染低(0.8mmol/L)、中(1.6mmol/L)、高(2.4mmol/L)三个剂量的氟化钠，并使用氯化钙调节培养基中的钙浓度，通过MTT实验检测细胞的增殖情况；通过RT-PCR的方法检测STC1的表达；提取细胞线粒体，检测线粒体肿胀程度、线粒体的膜电位和细胞内钙离子含量。
　　结果：肾小管上皮细胞的增殖活性随着染氟程度的增加而增大，并且在中氟组、高氟组出现了显著性降低(P<0.05)，高钙可以拮抗氟中毒对肾小管上皮细胞的增殖抑制作用；高表达UCP2的肾小管上皮细胞在染氟环境下其增殖活性变化不一，在低氟组和中氟组，转染了UCP2的HK2可以在一定程度上拮抗氟中毒给细胞造成的增殖抑制，虽未见明显差异，但出现了增殖活性升高的趋势。在高氟组，高表达了UCP2的HK2的增殖活性进一步降低，且与高氟组正常HK2比较后，出现了显著的抑制作用(P<0.05)。高钙可以拮抗氟中毒对高表达了UCP2的HK2细胞的增殖抑制作用，但差异不显著(P>0.05)。各剂量染氟组肾小管上皮细胞中STC1的mRNA表达与对照组大鼠比较均有明显提高，差异有显著性(P<0.05)；高钙可促进STC1的表达。高表达UCP2的HK2中STC1的表达均显著高于对应剂量的正常HK2组(P<0.05)。高钙可以使该表达增强，但差异无显著性(P>0.05)；肾小管上皮细胞内钙离子含量在不同剂量染氟组均显著高于对照组，且两两相比，差异有显著性(P<0.05)。当给予高钙处理后，正常肾小管上皮细胞中钙离子含量会出现显著降低，且两两相比，差异有显著性(P<0.05)；细胞内钙含量在转染了UCP2的肾小管上皮细胞高染氟组中较之正常HK2细胞高染氟组出现了显著下降，在低、中染氟组虽未出现显著的变化，但也呈现下降趋势(P>0.05)。在各染氟组给予转染了UCP2的肾小管上皮细胞高钙干预后，对照正常HK2的相应染氟组，细胞内钙含量出现了下降趋势，在中氟加钙、高氟加钙组出现了显著降低(P<0.05)
　　结论：氟中毒对肾小管上皮细胞的生存率有明显的抑制作用，并能提高UCP2、STC1的表达，这种改变可随着染氟剂量的增高而愈加明显；氟中毒能影响肾小管上皮细胞的线粒体解偶联功能，并且与染氟剂量呈一定的剂量相关性，因此可从细胞层面继续佐证UCP2、STC1和线粒体解偶联功能可能参与了氟中毒肾损伤的机制。高表达UCP2能促进STC1的表达，降低细胞内钙含量，拮抗线粒体解偶联功能的改变，但对细胞增殖活性具有双向性作用。