HBV蛋白通过转录因子YY1调节miRNAs形成相关因子DGCR8的表达

摘要

目的：
　　研究HBV蛋白对miRNAs形成相关因子DGCR8表达的调控作用，并对其作用机制进行初步探讨，为研究HBV引起的miRNAs异常表达机制提供一种新的思路。
　　方法：
　　1.用RT-PCR和Real-Time PCR的方法检测DGCR8在HepG2细胞及HepG2.2.15细胞中的差异表达，并将HBV表达质粒(pCH9/3091)瞬时转染HepG2细胞，进一步确证HBV对DGCR8表达的影响，最后用Western blot验证上述结果。
　　2.双荧光素酶报告系统分析HBV是否对DGCR8启动子有调节作用。首先构建DGCR8启动子质粒(pGL3-DGCR8-P)，将其与pCH9/3091共转染HepG2细胞，以此检测HBV对DGCR8启动子活性的影响。
　　3.构建HBV的四种蛋白的表达质粒HBc、HBp、HBs及HBx，分别与pGL3-DGCR8-P共转染HepG2细胞，分析HBV蛋白对DGCR8启动子活性的影响情况。在HepG2.2.15细胞中干扰掉相应蛋白，用双荧光素酶报告系统及Western blot验证上述蛋白对DGCR8表达的影响。
　　4.寻找DG6R8启动子上可能结合的转录因子，通过RT-PCR及Western blot的方法检测HBV对相关转录因子的mRNA和蛋白表达的影响。通过双荧光素酶报告系统检测相关转录因子对DGCR8启动子活性的影响，Western blot检测转录因子对DGCR8蛋白表达的影响，并用shRNA在HepG2.2.15细胞中干扰相应转录因子的表达，通过双荧光素酶报告系统和Western blot验证上述结果。
　　结果：
　　1.RT-PCR和Real-Time PCR结果显示，DG(38mRNA在HepG2.2.15细胞中的表达较HepG2细胞降低，将HBV表达质粒以一定的浓度梯度转染入HepG2细胞后可见DG(38的表达随HBV转染量的增高而降低，Western blot结果证实HBV可以下调DGCR8蛋白表达水平。
　　2.构建了DGCR8启动子表达质粒，并证明了其活性。将DGCR8启动子质粒与pCH9/3091共转HepG2细胞，发现HBV能降低DGCR8启动子的活性，并且HBV对启动子的抑制作用呈剂量依赖性，最后我们通过双荧光素酶报告系统进一步在稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞中验证了HBV对DGCR8启动子活性的抑制作用。
　　3.将HBV四种蛋白的表达质粒与DGCR8启动子质粒共染转HepG2细胞，发现HBs和HBx对DGCR8启动子活性影响最为明显。在HepG2.2.15细胞中分别抑制HBs和HBx的表达后，双荧光素酶报告系统检测显示DGCR8启动子活性有所恢复，Western blot检测显示DGCR8蛋白表达水平有所升高。
　　4.通过生物信息学的方法搜寻到DGCR8启动子区域有转录因子YY1的结合位点。首先我们通过RT-PCR和Western blot的方法证实了HBV可以促进YY1的表达。然后将YY1的表达质粒与DGCR8启动子共转染HepG2细胞后发现YY1能下调DGCR8启动子活性，Western blot实验也验证了这一结果。随后在HepG2.2.15细胞中抑制YY1的表达，DGCR8启动子活性有所升高，DGCR8蛋白表达水平也升高。
　　结论：
　　HBV能通过减弱DGCR8启动子活性降低其转录水平和蛋白水平的表达，其中HBs和HBx蛋白起主要作用，这一过程可能是通过转录因子YY1介导的。本研究探讨了HBV对DGC38表达的调节机制，为研究HBV导致的miRNA的异常表达提供了新的思路，进一步阐明了HBV的生物学作用。