溶血磷脂酸对背根神经髓鞘相关糖蛋白和髓鞘形成负性调节转录因子c-jun表达的影响及机制的研究

摘要

[目的]
　　 探讨单次鞘内注射溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid LPA)对背根神经(dorsal root DR)髓鞘相关糖蛋白(myeline-associated glycoprotein MAG)表达的影响以及其作用机制；探讨LPA对背根神经髓鞘相关基因Mag表达的影响；探讨LPA对髓鞘形成的负性调节转录因子c-Jun和p-cJun表达的影响及其作用机制，多层次研究LPA诱导神经病理性疼痛脱髓鞘的详细机制，寻找缓解或阻止神经病理性疼痛的新靶点。
　　 [方法]
　　 1、给雄性的C56小鼠单次鞘内注射(intrathecal injection i.t.)LPA(10nmol)，设立Vehicle组(人造脑脊液artificial cerebralspinal fluid aCSF)，在不同的时间点(注射后24小时、3天、7天)，行DR MAG的western blot，观察其表达变化。
　　 2、在单次给雄性的C56小鼠LPA(10nmol i.t.)30分钟之前，给或不给钙蛋白酶抑制剂(calpain inhibitor)CalX(10nmol i.t.)，设立Vehicle-aCSF组，LPA注射24小时之后行DR MAG的免疫荧光染色和western blot，观察其表达变化。
　　 3、单次给雄性的C56小鼠LPA(10nmol i.t.)30分钟之前，给或不给钙蛋白酶抑制剂(calpain inhibitor)CalX(10nmoli.t.)。设立Vehicle-aCSF及CalX-aCSF组，在不同的时间点测小鼠的机械性痛敏和热痛敏(0天、1天、3天、7天、14天)。
　　 4、单次给雄性的C56小鼠LPA(1nmol i.t.)，在不同的时间点(1小时，3小时，1天，2天，3天，7天，14天)行髓鞘相关基因Mag的实时荧光定量PCR(Real-time PCR)。设立naive组。
　　 5、鞘内注射LPA(Inm01)，在不同的时间点(1小时，3小时，6小时，24小时，3天，5天)行c-Jun、p-c-Jun的western blot；或预先30分钟给予JNK抑制剂SP600125(0.5μg i.t.)，再给LPA(1nmol i.t.)，在不同的时间点(20分钟，40分钟60分钟，120分钟，180分钟)行c-Jun的western blot。
　　 [结果]
　　 LPA下调DR MAG的表达，在单次LPA注射后24小时显著的降低，而且3天后还能观察到降低，7天后降低不明显；预先30分钟给予CalX((10nmoli.t.)后，western blot结果显示能完全阻止LAP诱导DR MAG的下调，同时免疫荧光结果分析和western blot是一致的；钙蛋白酶抑制剂CalX在LPA注射后1-7天明显的降低了热痛敏和机械痛痛敏，但在Vehicle处理组CalX不起作用；鞘内注射LPA(1nmol)之后1小时髓鞘相关基因Mag的mRNA水平明显的降低，一直持续到注射后第7天，但第14天的时候不明显；给予LPA(1nmol i.t.)之后1个小时，c-Jun明显的升高，一直持续到第3天，但第5天不明显。p-c-Jun也在加LPA之后1小时，明显的升高，但只持续到6小时，24小时不明显。预先30分钟给JNK抑制剂SP600125之后，不能抑制DR c-Jun的升高。
　　 [结论]
　　 LPA可以诱导背根神经MAG的下调且是通过calpain激活介导的。在给予LPA之后背根神经髓鞘相关基因Mag是下调的，而转录因子c-Jun和p-c-Jun都是升高的，但c-Jun不是通过经典的JNK-c-Jun通路发挥作用。因此LPA诱导背根神经脱髓鞘的机制比较复杂，既有蛋白水平降解的机制，也有基因水平Mag的下调和转录因子c-Jun的参与。