siRNA沉默TRIM25基因对A549/DDP细胞顺铂耐药性及PKM2蛋白表达的影响

摘要

目的：通过沉默非小细胞肺癌耐顺铂细胞株A549/DDP细胞中的TRIM25基因，抑制E3泛素蛋白连结酶TRIM25表达，探讨TRIM25对A549/DDP细胞株药物敏感性、早期凋亡率，以及对肿瘤代谢中的关键酶---PKM2表达的影响，以期为肿瘤耐药研究提供新的实验依据。
　　方法：设计并合成针对TRIM25基因的特异性小干扰RNA(siRNA)片段，整合到质粒后，转染A549/DDP细胞。采用半定量PCR、定量PCR评价TRIM25基因沉默后对A549/DDP细胞TRIM25基因表达水平的影响；通过westernblot技术检测TRIM25蛋白表达水平的影响；利用MTT实验和流式凋亡实验分别评价A549/DDP细胞在顺铂作用下耐药性和凋亡等生物学功能；采用免疫荧光技术、westernblot技术同时检测TRIM25与PKM2的蛋白表达量。
　　结果：1、转染TRIM25siRNA后，半定量PCR、定量PCR结果一致，mRNA水平显著下降,尤其是siRNA干扰片段pGPU6-524mRNA水平显著下降，表达率为10.8％。westernblot结果与定量PCR有相同趋势，实验组的TRIM25蛋白表达量下降，其中以pGPU6-524最为明显。根据上述结果，选取干扰片段pGPU6-524进行后续功能实验。
　　2、抑制A549/DDP细胞中TRIM25的表达，A549/DDP细胞耐药指数（RI）下降为7.38，提高了其对顺铂的敏感性，同时上调了该细胞的早期凋亡率。
　　3、免疫荧光实验与Western-Blot结果一致，抑制A549/DDP细胞中TRIM25的表达，使PKM2表达增加。
　　结论：本研究表明，TRIM25通过调控PKM2表达，增加其敏感性，对人肺腺癌细胞株的顺铂耐药性产生重要影响，这为肺癌耐药机制研究提供了重要的实验依据。

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前言

第一部分 TRIM25靶向siRNA真核表达质粒的构建

1材料和方法

2. 结果

3. 讨论

第二部分 siRNA沉默TRIM25对肺腺癌细胞耐药、凋亡及PKM2蛋白表达的影响研究

1 材料和方法

2.结果

3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述: 肿瘤耐药蛋白

致谢

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