沉默Gli1基因对人肺腺癌细胞株A549/DDP顺铂耐药性的影响

摘要

目的:以Gli1 siRNA转染人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP，研究基因沉默效应对靶细胞顺铂耐药性的影响及可能机制。
　　方法
　　1应用MTT法测定顺铂对A549、A549/DDP细胞的半数抑制浓度(IC50)，从而计算A549/DDP细胞的耐药指数。
　　2采用qRT-PCR和western blot分别从mRNA和蛋白水平检测A549及A549/DDP细胞中Gli1的表达。
　　3以Gli1 siRNA转染A549/DDP细胞。qRT-PCR、Western blot及细胞免疫荧光分别从mRNA和蛋白水平检测Gli1的干扰效果。
　　4 Western blot检测干扰后Gli1的下游蛋白Bcl-2、cyclinD2及caspases-3表达量的变化。
　　5 Hoechst33258染色及流式细胞术分别测定转染后细胞的自发性凋亡情况及细胞周期变化。
　　6 MTT法测定转染后顺铂对各组细胞抑制率的变化;AnnexinⅤ-FITC法检测顺铂诱导的各组细胞凋亡率。
　　结果
　　1顺铂对A549和A549/DDP细胞的的IC50分别为2.38±0.31μg/mL和16.75±0.54μg/mL，A549/DDP细胞耐药指数约为7.04(P＜0.001)，为中等耐药细胞株。
　　2与A549细胞相比，A549/DDP细胞中Gli1在mRNA和蛋白水平的表达均显著增高(P＜0.01)。
　　3转染Gli1 siRNA后48h，实验组Gli1 mRNA和Gli1蛋白的表达量明显低于阴性转染组及空白对照组(P＜0.001)。
　　4转染后48 h实验组Bcl-2、cyclinD2的表达量显著低于阴性转染组和空白对照组(P＜0.01);而凋亡蛋白caspases-3在实验组的表达量明显高于在阴性转染组和空白对照组中的表达(P＜0.001)。
　　5转染48h后，利用Hochest33258对细胞进行染色。可见实验组发生核固缩和核亮染的细胞数量明显多于阴性转染组及空白对照组。细胞周期显示:实验组G1期(77.54±0.71％)，S期(17.72±0.66％) vs阴性转染组G1期(62.47±1.15％)，S期(33.50±1.05％)/空白对照组G1期(61.88±1.18％),S期(32.93±1.76％)(P＜0.001)。
　　6 MTT结果示: IC50值由干扰前的12.63±1.11μg/mL/13.81±1.14μg/mL下降为干扰后的2.65±0.85μg/mL(P＜0.001)。顺铂诱导的细胞凋亡率:实验组35.19±3.92％;阴性转染组6.43±0.11％;空白对照组5.01±0.77％(P＜0.001)。
　　结论
　　1 Gli1基因在人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP中的表达明显高于顺铂敏感株A549，提示Gli1与肺癌顺铂耐药可能相关。
　　2利用RNA干扰技术能显著抑制Gli1基因的表达，从而下调Bcl-2、cyclinD2蛋白水平，提高A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

第一部分 Gli1在人肺癌细胞株A549和A549／DDP中的表达差异

1 材料与方法

2 结果

第二部分 siRNA沉默Gli1基因逆转人肺腺癌耐顺铂细胞株A549／DDP的耐药性

1 材料与方法

2 结果

讨论

全文小结

参考文献

文献综述 Hedgehog-Gli信号通路的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的论文