NLS-RARα基因对HL-60细胞增殖及ATRA诱导的HL-60细胞分化的影响及其机制的研究

摘要

第一部分重组腺病毒Ad-NLS-RARα的构建及其在K562细胞中的表达
　　目的:应用AdEasy-1腺病毒载体系统构建含NLS-RARα基因的重组腺病毒Ad-NLS-RARα，并检测其在K562细胞中的表达情况。
　　方法:以pGBKT7-PML-RARα质粒为模板，PCR扩增NLS-RARα基因，克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrace-TO4中，构建重组穿梭质粒pAdTrace-TO4-NLS-RARα，经PmeI酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌感受态中进行同源重组，卡那霉素抗性筛选，获得重组腺病毒质粒pAd-NLS-RARα，经PacI酶切线性化后，通过脂质体LipofectamineTM2000转染AD293细胞进行包装，获得重组腺病毒Ad-NLS-RARα，同时包装扩增阴性对照腺病毒Ad-KZ，经4轮扩增后，测定腺病毒滴度，经PCR和测序验证;阳性重组腺病毒感染K562细胞，FCM测定感染效率，RT-PCR和Western blot检测NLS-RARα基因在K562细胞中的转录及蛋白的表达情况。
　　结果:重组腺病毒Ad-NLS-RARα经PCR和测序鉴定构建正确;经4轮扩增后，重组腺病毒Ad-NLS-RARα滴度可达6.9×108pfu/ml;其对K562细胞的感染效率可达70％;RT-PCR和Western-blot结果显示，重组腺病毒Ad-NLS-RARα携带的NLS-RARα基因可以在K562细胞中高效表达。
　　结论:成功包装并且扩增重组腺病毒Ad-NLS-RARα，并且可以在K562细胞中高效表达NLS-RARα基因。
　　第二部分重组腺病毒Ad-NLS-RARα对HL-60细胞增殖及ATRA诱导的HL-60细胞分化的影响及其机制的研究
　　目的:将已构建验证成功的重组腺病毒Ad-NLS-RARα和阴性对照腺病毒Ad-KZ感染至HL-60细胞中，探讨其对HL-60细胞增殖及ATRA诱导的HL-60细胞分化的影响及机制。
　　方法:经验证正确的腺病毒经Protamine sulfate辅助感染HL-60细胞，检测感染效率，用RT-PCR和Western-blot检测目的基因在HL-60细胞中的表达情况。MTT法检测细胞增殖情况。病毒感染HL-60细胞24h后，用2.5μmol/LATRA处理，流式细胞术(FCM)检测细胞表面分化抗原CD11b的表达。RT-PCR和Western-blot检测C-MYC基因在mRNA和蛋白水平的表达。
　　结果:在Protamine sulfate辅助感染作用下，重组腺病毒Ad-NLS-RARα和阴性对照腺病毒Ad-KZ对HL-60细胞的感染效率可达70％-80％。NLS-RARα基因的RT-PCR和Western-blot结果显示，感染了重组腺病毒Ad-NLS-RARα的HL-60细胞的NLS-RARα基因的mRNA及蛋白表达水平明显增高(P＜0.05)。MTT法检测表明感染了重组腺病毒Ad-NLS-RARα的细胞增殖能力增高(P＜0.05)。FCM检测结果显示，经ATRA处理后，感染Ad-NLS-RARα重组腺病毒的HL-60细胞，CD11b表达较阴性对照组和未感染组下调(P＜0.05)。C-MYC基因的RT-PCR和Western-blot检测结果表明，经ATRA处理后，感染Ad-NLS-RARα重组腺病毒的细胞C-MYC基因的mRNA和蛋白水平均高于其他两组(P＜0.05)。
　　结论:重组腺病毒Ad-NLS-RARα可以促进HL-60细胞的增殖，并通过上调C-MYC基因的表达，抑制ATRA诱导的HL-60细胞分化。
　　第三部分 RNA干扰NLS-RARα基因对HL-60细胞增殖及分化的影响
　　目的:探讨抑制NLS-RARα基因表达对HL-60细胞株增殖及分化的影响。
　　方法:合成针对NLS-RARα的短发夹RNA(Short hairpin RNA，shRNA)真核表达质粒和阴性对照质粒，脂质体法转染HL-60细胞;经G418筛选出稳定转染的细胞;RT-PCR及QRT-PCR法检测各组细胞NLS-RARα基因mRNA表达水平;Western-blot法检测各组细胞NLS-RARα蛋白表达水平;MTT法检测细胞增殖活性;流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）检测细胞周期分布和细胞表面分化抗原CD11b的表达。
　　结果:RT-PCR、QRT-PCR和Western-blot结果表明干扰组HL-60细胞NLS-RARαmRNA和蛋白质的表达明显下调(P＜0.05); MTT法结果表明干扰组细胞增殖能力降低(P＜0.05); FCM检测结果显示，干扰组G1、G2期细胞明显增加，S期细胞明显减少，CD11b表达明显升高(P＜0.05)。
　　结论:干扰NLS-RARα基因的表达可以抑制HL-60细胞的增殖，促进其分化。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

第一部分 重组腺病毒Ad-NLS-RARα的构建及其在K562细胞中的表达

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二部分 重组腺病毒Ad-NLS-RARα对HL-60细胞增殖及ATRA诱导的HL-60细胞分化的影响及其机制

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三部分 RNA干扰NLS-RARα基因对HL-60细胞增殖及分化的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文总结

文献综述 ATO治疗APL研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文