JWA、bcl-2基因对AsO联合维生素C、GM-CSF诱导HL-60、NB4细胞分化和凋亡的影响及可能机制

摘要

JWA(AF070523)是周建伟等从培养的原代人气管和支气管上皮细胞中分离并克隆的受全反式维甲酸(alltransretinoicacid，ATRA)诱导的新的细胞骨架样基因。JWA基因cDNA包含2114个核苷酸，编码188个氨基酸，其启动子序列中含有多种反应元件，如TRE、SRE和RARE等。前期的研究结果表明JWA受多种诱导分化剂和环境应激等调节，其功能与白血病细胞的分化和凋亡有关。十多年来，三氧化二砷(As2O3或ATO)已成为全世界公认的治疗难治和复发性APL(AML-M3)的有效药物。近期的研究已经证明ATO的促凋亡作用并不只是针对M3，对非M3-AML也有作用，尽管后者对ATO的敏感性只有前者的1/10或更少。然而，长期接触砷剂所造成的毒性作用和潜在致癌性却不容忽视。探求与ATO具有协同作用的联合治疗，最大可能地减少ATO剂量，降低细胞毒作用已成为该领域研究的焦点。维生素C(AA)是一种细胞因子信号通路的调节子，作为有望诱导本身对ATO并不敏感的细胞发生分化和凋亡的药物而备受人们的关注。G-CSF、GM-CSF等生长因子诱导ROS产生，而ATO的分子靶向作用很大程度上取决于靶细胞内ROS的浓度。本研究的目的在于通过研究JWA、bcl-2基因对低剂量ATO与维生素C、GM-CSF联合诱导HL-60、NB4细胞分化和凋亡的影响，进一步探讨ATO联合用药在不同白血病作用的分子基础，为临床制定合理的治疗方案提供更多的理论依据。同时，对201例白血病患者和243例健康者对照进行了JWA基因单核苷酸多态性(SNP)分析，试图进一步从分子流行病学的角度对JWA基因多态性与中国汉族人群白血病发病的危险性进行相关性研究，探讨2JWA基因SNP与各类白血病易感性的联系，为白血病的预防和治疗提供新的理论依据。 一、JWA、bcl-2基因对ATO联合AA、GM-CSF诱导HL-60、NB4细胞分化和凋亡的影响及意义： 本课题在既往单药诱导HL-60、NB4细胞等分化和/或细胞凋亡模型中JWA及相关抗凋亡基因bcl-2、hsp70等表达研究结果的基础上，进一步以HL-60细胞株为非M3的AML研究模型、NB4细胞株为M3研究模型，分别以ATO(1μM)联合AA(300μM)和/或GM-CSF(20ng/ml)处理上述细胞，采用流式细胞仪(FCM)、细胞形态学分析以及蛋白印迹(Westernblot)等技术初步比较了经各组药物作用后HL-60和NB4细胞分化及凋亡的动态变化；比较JWA和bcl-2基因在蛋白水平表达趋势的异同，探讨ATO为主的联合方案对M3和非M3白血病细胞分化及凋亡影响可能的作用机制。我们的研究结果提示： 1.低浓度ATO(1μM)处理HL-60细胞后，JWA基因随作用时间延长有所上升，72h最为明显；CD11b表达增加，细胞出现分化；而bcl-2基因则无有意义的变化。同样剂量ATO处理NB4细胞后，则出现显著的细胞凋亡特征。特别是ATO处理NB4细胞72h时，FCM检测细胞凋亡率达55.7﹪，是同组同时段HL-60细胞的14倍之多；bcl-2基因的表达与JWA基因呈正相关。 2.ATO联合AA(300μM)处理HL-60细胞48h时大多细胞出现了分化迹象，少数细胞出现时间依赖性细胞坏死；JWA基因在48h前呈时间依赖性增高，72h时反而较48h时表达减低。而ATO+AA处理NB4细胞后，72h时细胞凋亡率比同时段ATO组减少3.5倍；JWA基因在48h前均呈明显下调趋势，而72h时较48h有所上调，与同组处理HL-60细胞相同时段的变化规律呈负相关。 3.以上结果提示：同样浓度的ATO±AA在HL-60细胞主要以诱导分化为主，其分化程度与JWA基因表达呈大致正相关；而NB4细胞则以诱导细胞凋亡为主，与JWA基因表达呈负相关。JWA基因可能在ATO联合AA诱导HL-60及NB4细胞分化或凋亡中的作用不同。ATO与AA联合用药并不能强化ATO诱导HL-60细胞分化的作用，bcl-2也未显示有意义的变化，说明1μMATO+300μMAA在一定时间内对3HL-60细胞的诱导作用并不受bcl-2基因的调控。 4.ATO和GM-CSF(20ng/ml)联合处理HL-60和NB4细胞，CD11b及细胞形态学分析佐证两者均出现细胞分化迹象，但JWA基因呈反向变化趋势：即在HL-60细胞呈时间依赖性升高，而在NB4细胞则呈下调趋势；bcl-2基因的表达在HL-60细胞与JWA呈负相关，而在NB4细胞则无有意义的变化。GM-CSF与ATO在诱导HL-60和NB4细胞分化方面具有较明显的协同作用，但JWA基因的表达趋势却迥异，说明JWA基因在ATO和GM-CSF联合诱导M3及非M3白血病细胞分化中涉及不同的诱导分化机制，值得进一步研究。 5.ATO+GM-CSF+AA三药联合作用模型中，HL-60细胞和NB细胞均表现为细胞增殖受抑，出现明显的细胞凋亡和细胞坏死，bcl-2基因表达随药物作用时间的延长明显下降，说明GM-CSF和AA在体外细胞培养中所致的部分氧化应激作用可能进一步强化了细胞毒效应。JWA基因均呈不规则的变化。提示JWA基因涉及的细胞生存调控机制十分复杂，推测JWA在诱导细胞分化和凋亡中具有双重效应。特别是三药联合作用后，使药物间的相互作用更趋复杂。 6.GM-CSF与其他药物联合使用在诱导细胞分化和凋亡过程中具有协同效应；三药联合应用诱导的HL-60细胞和NB4细胞凋亡受bcl-2的调控。因此，临床上应充分地考虑GM-CSF、G-CSF等细胞因子的使用时机和合理配伍对于最大程度地杀灭白血病细胞、减少细胞耐药、保护正常细胞功能的重要性。 二、JWA基因多态性与各类白血病发生的相关性研究： 从上述细胞模型的研究结果以及课题组应用反义寡核苷酸和RNA干涉技术下调或关闭JWA基因使ATRA、TPA等诱导的HL-60细胞、NB4细胞分化和凋亡能力明显受抑的研究结果证明：JWA基因广泛参与调节多种化学药物诱导的白血病细胞定向分化和凋亡。尽管如此，JWA作为一个潜在的功能基因，其关键的生物学功能和相关分子机制目前仍然不清楚。本课题对201例华东地区白血病患者及243例健康者JWA基因单核苷酸多态性(SNP)进行了比较分析，发现两个JWA基因的SNP位点(-76G＞C和723T＞G)与白血病危险性的相关性具有统计学意义。但其中并未发现4白血病种类特异性，提示JWA基因的SNPs可能与白血病发生的总体机制相关。我们发现，-76C等位基因与白血病危险性增加有关(-76GC：OR=1.88；95﹪CI=1.06～3.37，P=0.0403)；而723G等位基因则与白血病危险性降低有关，(723TG：OR=0.55，95﹪CI=0.37～0.82，P=0.0044；723GG：OR=0.45，95﹪CI=0.22～0.91，P=0.0044；以及723TG+GG：OR=0.53，95﹪CI=0.37～0.78，P=0.0012)。报告基因分析提示-76G＞C多态性可能是功能性的，-76C等位基因对环境氧化应激刺激应答过程中可减少或关闭JWA启动子的作用。我们首次报道723TG和GG多态性在白血病具有保护性相关意义，尽管其功能还有待于进一步确立。

目录

缩略语

摘要

第一部分JWA、bcl-2对As2O3联合维生素C、GM-CSF诱导HL-60、NB4细胞分化和凋亡的影响及意义

前言

主要仪器设备

材料与方法

结果

分析与讨论

小结

参考文献

第二部分JWA基因多态性与各类白血病发生的相关性研究

致谢

白血病的分子机制及治疗策略—根除白血病干细胞

JWA,a novel signaling molecule,involved in the induction of differentiation of human myeloid leukemia cells

JW A基因在HL-60细胞定向分化中的表达及意及

慢性髓系白血病首发血小板显著增多

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