BMPs在小鼠椎间盘发育中差异表达谱及对椎间盘细胞影响的研究

摘要

青少年特发性脊柱侧弯(adolescent idiopathic scoliosis AIS)是一种严重的发育畸形，特指初诊年龄在10～18周岁的特发性脊柱侧弯患儿。因其发病原因至今都不清楚，因此对于AIS的治疗主要是对症治疗，治疗效果并不十分理想。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)作为一种多功能的成骨相关因子，对胚胎期的骨形成及生后的成骨有极其重要的作用。提示我们可以从BMPs的角度，去解释临床上一些骨形成方面异常的疾病如特发性脊柱侧弯(idiopathic scoliosis IS)。
　　本研究将探索在小鼠脊柱椎间盘生长过程中成骨相关BMPs的表达情况及对椎间盘细胞成骨和成软骨的影响，为从骨骼发育异常角度解释青少年特发性脊柱侧弯的发生发展提供重要的基础研究。
　　第一部分、骨形成蛋白信号分子在小鼠椎间盘发育中的表达
　　目的:探索促进成骨相关的骨形成蛋白-2、-4、-6、-7、-9（BMP-2、-4、-6、-7、-9）以及抑制成骨作用的BMP-3在小鼠不同发育年龄段椎间盘中的表达水平及变化趋势，为椎间盘发育过程中BMP信号途径的研究奠定重要基础。
　　方法:解剖获取出生后1d、3d、1周、1个月、3个月、6个月龄小鼠的椎间盘及胸腰椎脊柱。RT-PCR检测BMP-2、-3、-4、-6、-7、-9在生后不同年龄段小鼠椎间盘的表达情况，免疫印迹及免疫组织化学验证在RT-PCR中有明显表达差异的BMP-3、-6。
　　结果:RT-PCR结果显示BMP-2、-7、-9的表达在小鼠椎间盘组织中有一定的基础表达，但随着年龄增大没有明显的变化趋势，而BMP-3和BMP-6的表达整体呈现出下降的趋势，BMP-4在椎间盘中无表达，免疫印迹及免疫组织化学结果也证实BMP-3和BMP-6，随着小鼠椎间盘的发育表达降低。
　　结论:各成骨BMPs在正常小鼠脊柱的发育过程中表达水平不同，其中BMP-3和-6可能发挥着与其他成骨BMPs不同的生理作用。
　　第二部分、BMPs对胚胎小鼠椎间盘细胞成软骨及成骨作用
　　目的:探索成骨作用的BMP-2及抑制成骨作用的BMP-3对胚胎小鼠椎间盘细胞的成软骨及成骨作用，为BMPs用于临床治疗椎间盘相关疾病提供实验依据。
　　方法:利用腺病毒介导的BMP-2和-3在胚胎小鼠椎间盘细胞中过表达，RT-PCR检测 Osteocalcin(OC)、Osteoprotegerin(OPG)和Osteopontin(OPN)成骨相关指标mRNA水平的表达，Alkalinephosphatase(ALP)读数及ALP染色检测ALP的活性。
　　结果:BMP-2和BMP-3过表达对于椎间盘纤维环(annulus fibrosusAF)细胞的成骨没有作用。但可促进椎闾盘髓核(nucleus pulposus NP)细胞的成骨，其中BMP-2和BMP-3均可促进OC mRNA的表达升高，而仅BMP-2可促进其OPG和OPN的mRNA表达升高。NP细胞在BMP-2和-3腺病毒感染后ALP活性明显增强，在AF细胞中则没有观察到这种变化。
　　结论: BMP-2和-3均可促进胚胎小鼠NP细胞的成骨作用，但对AF细胞的成骨用没有影响。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

参考文献

第一部分 骨形成蛋白信号分子在小鼠椎间盘发育中的表达

1 材料和方法

1．1 主要材料及试剂

1．2 获取各年龄段小鼠的脊柱及椎间盘

1．3 提取RNA

1．4 提取蛋白

1．5 逆转录RNA及Touch-down RT-PCR

1．6 免疫印迹

1．7 免疫组织化学

1．8 统计学分析

2 结果

2．1 RT-PCR

2．2 Western blotting检测BMP-3与BMP-6的表达及变化趋势

2．3 H-E染色

2．4 免疫组织化学

3 讨论

参考文献

第二部分 BMP-2和BMP-3对胚胎小鼠椎间盘细胞成骨作用

1．材料与方法

1．1 材料和试剂

1．2 研究方法

1．3 统计分析

2 结果

2．1 细胞培养及病毒感染情况

2．2 RT-PCR检测成骨相关指标

2．3 ALP读数

2．4 ALP染色

3 讨论

参考文献

全文总结

研究展望

文献综述 青少年脊柱侧弯病因学研究进展

致谢

攻读硕士期间所发表的论文