表皮神经嵴干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究

摘要

目的:
　　建立绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)转基因大鼠来源的表皮神经嵴干细胞(epidermal neural crest stem cells，EPI-NCSCs)培养方法，为研究EPI-NCSC在移植修复脊髓损伤奠定基础;探讨EPI-NCSCs移植对大鼠损伤脊髓的修复作用，以及对受体组织内脑源性神经生长因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、胶质细胞源性神经营养因子(glialcell line-derived neurotrophic factor，GDNF)、Nogo-A表达的影响。
　　方法:
　　取GFP大鼠触须垫毛囊，将毛囊隆突部放入用鼠尾胶原处理过的培养板上。培养第3d有细胞从毛囊隆突爬出，去除贴附的毛囊隆突部，胰酶重悬细胞并传代培养，细胞使用Sox10以及Nestin免疫细胞化学染色进行鉴定，测量EPI-NCSCs纯度。
　　60只SD大鼠均暴露T10节段脊髓，并在NYU-Ⅱ撞击机，以10g-25mm致伤力挫伤脊髓制作脊髓损伤(SCI)模型，随机分为空白损伤组（A组）、DMEM移植组（B组）、表皮神经嵴干细胞移植组（C组）。SCI模型大鼠损伤一周后将EPI-NCSCs细胞悬液移植入大鼠脊髓损伤处，DMEM组用单纯的DMEM/F12代替，空白损伤组不做处理。移植术后第1周、2周、3周、4周、5周、6周根据BBB(Basso-Beattie-Breanahan locomotor rating scale)评分细则评分。
　　移植术后1周，每组随机取动物3只，取T10节段区脊髓组织约15 mm，抽提组织总蛋白，使用NGF、BDNF的酶联免疫(enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)试剂盒检测各组脊髓组织内NGF、BDNF的表达量。
　　移植术后3周，每组随机取动物3只，取T10节段区脊髓组织约15 mm，制成冰冻切片，使用免疫组化方法，检测各组脊髓内BDNF的表达，使用免疫荧光染色方法，检测各组脊髓内BDNF、Nogo-A的表达。取T10为中心脊髓组织15 mm，提取蛋白，采用NGF、BDNF的ELISA试剂盒检测各组脊髓组织内NGF、BDNF的表达量。采用Western blot方法检测各组脊髓内Nogo-A的表达。
　　移植术后6周，每组随机取动物3只，取T10节段区脊髓组织约15 mm，制成冰冻切片，使用免疫组化方法，检测各组脊髓内BDNF、GDNF、NGF的表达，使用免疫荧光染色方法，检测各组脊髓内BDNF、GDNF、NGF、Nogo-A的表达。取T10为中心脊髓组织15 mm，提取蛋白，使用NGF、BDNF的ELISA试剂盒检测各组脊髓组织内NGF、BDNF的表达量。使用Western blot方法检测各组脊髓内BDNF、Nogo-A的表达。使用实时荧光定量PCR方法，检测各组脊髓内GDNF的表达。
　　结果:
　　GFP大鼠来源的EPI-NCSCs在荧光显微镜下均可观察到有天然稳定的亮绿色荧光。培养第3d细胞以隆突部为中心向外周伸展，刚爬出的细胞多呈卵圆形，随后长出突起，细胞可见分裂象，呈哑铃形。传代培养的细胞形态多为圆形，也可见梭形和三角形。经Sox10以及Nestin免疫荧光细胞化学染色鉴定，该方法培养出的EPI-NCSCs纯度可在90％以上。
　　移植术后，各组大鼠后肢功能有所恢复，从第2周起C组大鼠双下肢1-2个关节开始有轻微活动;移植术后4周，C组大鼠常见双下肢3个关节大幅活动;移植术后6周C组大鼠足底负重步行，A组和B组大鼠拖动后肢前行，足置于不负重位。C组大鼠的运动功能相对于其他两组显著提高。表明EPI-NCSCs移植可促进SCI大鼠运动功能的恢复。
　　移植术后1周，经ELISA检测，三组大鼠脊髓内BDNF、NGF的表达量差异没有统计学意义。
　　移植术后3周，ELISA结果显示，C组BDNF、NGF表达高于A组和B组(P＜0.05);经免疫组化发现A组和B组有少量细胞胞浆呈现NGF、BDNF棕黄色阳性染色，分布于脊髓的灰质和白质，而C组可见EPI-NCSCs及移植细胞周围的脊髓组织呈大量棕黄色阳性反应;免疫荧光组织染色可见C组BDNF阳性细胞增多，表达量高于同期A、B两组，同时，C组Nogo-A阳性细胞减少，表达量低于同期A、B两组;经Westernblot检测，C组Nogo-A表达低于A组和B组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　移植术后6周，ELISA结果显示，C组BDNF、NGF表达持续升高，表达量同期A、B两组比较，差异有统计学意义(P＜0.05);经免疫组化发现A组和B组有部分细胞胞浆呈现BDNF、GDNF、NGF棕黄色阳性染色，分布于脊髓的灰质和白质，而C组可见EPI-NCSCs及移植细胞周围的脊髓组织呈大量棕黄色阳性反应;免疫荧光组织染色可见C组BDNF、GDNF、NGF阳性细胞增多，表达量高于同期A、B两组，同时，C组Nogo-A阳性细胞比3周时表达更少，表达量低于同期A、B两组;经Western blot检测，C组Nogo-A表达明显低于A组和B组，差异有统计学意义(P＜0.05)，同时，C组BDNF表达高于同期A组和B组，差异有统计学意义(P＜0.05);C组GDNFmRNA表达最强，高于同期A组和B组，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　结论:
　　1.本实验培养的EPI-NCSCs来源于GFP转基因大鼠，分离的细胞具有天然稳定的绿色荧光标记，是研究EPI-NCSCs移植修复脊髓损伤作用机制的理想工具。
　　2.大鼠脊髓损伤后移植EPI-NCSCs能促进其运动功能恢复。
　　3.EPI-NCSCs的移植能修复损伤脊髓，其机制可能与其促进损伤脊髓内神经营养因子，如BDNF、GDNF、NGF的表达，以及抑制损伤脊髓内神经生长抑制因子，如Nogo-A的表达有关。

目录

声明

符号说明

摘要

前言

第一部分 表皮神经嵴千细胞的分离培养及鉴定

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二部分 表皮神经嵴干细胞对损伤脊髓的修复作用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

全文总结

参考文献

附图

文献综述 表皮神经嵴干细胞在修复脊髓损伤中的作用

致谢

攻读硕士期间发表的论文