麝香酮对大鼠原代脊髓星形胶质细胞损伤及急性脊髓损伤保护的研究

摘要

第一部分麝香酮对原代脊髓星形胶质细胞损伤的影响
　　目的：
　　建立星形胶质细胞的机械化学损伤模型，评估不同浓度的麝香酮对星形胶质细胞损伤的作用。
　　方法：
　　采用差速贴壁法和短期暴露相结合的方法获取脊髓星形胶质细胞。采取2mm间距行“井”法对培养的星形胶质细胞进行划伤，建立星形胶质细胞的机械模型，在机械模型中加入500mmol/l谷氨酸共培养，建立星形胶质细胞机械-化学损伤模型，在建立模型后24小时用盼蓝染色法测定细胞死亡率、LDH漏出率的检测。对星形胶质细胞进行分组:A组（单纯培养），B组（机械化学损伤后继续培养），C组（机械化学损伤后加入3ug/ml麝香酮），D组（机械化学损伤后加入6ug/ml麝香酮），E组（损伤后加入12ug/ml麝香酮）。分别在6h、12h、24h、48h、72h作MTT检测。在3h、6h、12h时检测SOD、MDA、LDH、TNF-α、细胞内Ca2+。
　　结果：
　　获得了95％以上的高纯度的脊髓星形胶质细胞。建立了大鼠原代脊髓星形胶质细胞机械、机械化学损伤模型。24小时A组未见死亡细胞，在机械损伤模型死亡率在23.57％;在机械化学损伤模型死亡率在36.27％。作MTT检测发现C、D、E组细胞损伤程度有所减轻，不同浓度的麝香酮发挥最强功效的时间则不同。在24小时检测LDH的漏出B组比A组明显增加，并随时间的延长而漏出加重，A组无明显的变化，C、D、E组都明显的下降，D组效果最好LDH抑制率(％)达88.27％。SOD检测提示:A组无明显的变化，B组明显的下降，C、D、E组比B组高，以D组在同一时间点最明显。MDA检测提示A组无明显的变化，B组比A组升高，C、D、E组比B组明显低，D组在同一时间点最低。TNF-α检测、细胞内钙检测与MDA有类似的变化。C、D、E组与A组和B组有显著性差异(P＜0.05)。
　　结论：
　　成功建立了星形胶质细胞的机械-化学损伤模型;不同浓度的麝香酮对机械-化学损伤的星形胶质细胞都有保护作用，以6ug/ml浓度效果最好。
　　第二部分麝香酮对原代脊髓星形胶质细胞损伤保护机制的探讨
　　目的：
　　探讨麝香酮对原代脊髓星形胶质细胞损伤的保护机制。
　　方法：
　　实验分组:A组（C组加6ug/ml麝香酮）;B组（物理化学损伤模型）;C组（划伤模型）;D组（B组加6ug/ml麝香酮）;E组(B组加50umol/l MK801);F组（D组加MK801），分别在3h、6h、12h用ELISA法检测上清谷氨酸浓度、流式法检测细胞内钙浓度，在6h时行Q-PCR、western blot检测EAAT，ERK1/2、GFAP的mRNA、蛋白的表达，并在6h、12h、24h、48h观察各组的形态变化。
　　结果：
　　在3个时间点A组谷氨酸浓度比C组低，B组为最高;D组比B组明显低，E组比B组低，但高于D组，F组比B、D、E组低(P＜0.001)。在3h、6h、12h用流式法检测星形胶质细胞内Ca2+浓度，A组比C组降，B组为最高，D组比B组低，E组比B组低，但高于D组，F组都低于B、D、E组;3小时、6小时P＜0.05;12小时，P＜0.0001。选用QRT-PCR检测EAAT，ERK1/2、GFAP的mRNA的表达，在EAAT的mRNA对比值方面，A组比C组低，B组最高，D组比B组明显降低，E组比B组降低，但高于D组，F组比B、D、A组的E组低;在GFAP的mRNA对比值方面，A组比C组低，B组最高，D组比B组明显低;E组比B、D组低，F组最低;在ERK1/2的mRNA对比值方面与GFAP类似，A组最低。western blot检测EAAT，ERK1/2、GFAP蛋白表达与对应的mRNA的趋势一样。GFAP染色:6小时见明显的划伤带，胶质细胞生长少，A、C组细胞体积增大不明显，未见固缩的细胞;B、D、E、F组见细胞增大、偶见核固缩;以B、E组明显，偶见坏死。12小时划伤带仍明显，胶质细胞生长较多，核固缩，在B、D、E、F组出现了坏死，以B组明显。24小时划伤带隐约可见，细胞增生、肥大明显;B组见大量核固缩、坏死;C组偶见核固缩;D组可见划伤致坏死，增生肥大细胞少;E组细胞肥大，核固缩、坏死并存;F组细胞肥大，可见核固缩。48小时各组见划伤区细胞肥大明显，核固缩，A组最轻，C组次之;B组最明显，核固缩、坏死并存较多，其余组比B组轻。
　　结论：
　　麝香酮降低了星形胶质细胞膜上EAAT的mRNA和蛋白的表达、降低了谷氨酸的浓度，抑制了钙内流，抑制了ERK1/2、GFAP的mRNA和蛋白的表达，抑制了星形胶质细胞的肥大、增生。
　　第三部分麝香酮对大鼠急性脊髓损伤保护的研究
　　目的：
　　评估麝香酮对大鼠急性脊髓损伤的作用效果。
　　方法：
　　用Allen's法建立急性脊髓损伤模型，将120只大鼠随机分成五组，NS组（生理盐水组）、MP组（甲基强的松龙组）、MO1组(麝香酮2.5mg/kg)、MO2组(麝香酮5mg/kg)、MO3组(麝香酮10mg/kg)。MO1组、MO2组、MO3组为脊髓损伤后立即分别从尾根静脉注入2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg的麝香酮，连续7天;MP组为术后立即注入30mg/kg的甲基强的松龙;NS组则注入等量生理盐水。术后在3h、8h、1d、3d、1w、2w每组随机取4只动物，提取血清，ELISA法检测SOD、MDA、IL-6、IL-1β、TNF-a;术后8h、1d、3d、1w、2w、4w每组随机取3只动物，切取脊髓组织，行H-E染色、尼氏染色、免疫细胞化学染色:GFAP，并计算每视野观察到的胶质细胞个数。术后1d、3d、1w、2w、4w各取1只动物Western-Blot法检测bcl-2、caspase-3、GFAP的蛋白表达。所在数据并行统计分析。
　　结果：
　　1、成功建立了急性脊髓损伤模型。2、ELISA法检测(1)SOD∶ NS组从术3小时至1周呈下降趋势，在2周时上升。MP组与麝香酮处理的3个组，从3小时逐渐上升在3天达峰值，后出现下降，在同一时间点，明显高于NS组，以MO3组最为明显，2周时最明下降，以MO1组最明显，MP组次之，MO2组仍最高。6个时间点，P＜0.001，所两两比较都有显著性差异。(2) MDA∶ NS组从3小时上升至1周，在2周时下降。MO3组值8小时达峰值，1天后出现了下降，MP组3天达峰值，后出现下降。MO1和MO2有MP组的趋势，MO2下降最低，各时间点，P＜0.001。(3) TNF-α∶ NS组从3小时缓慢上升趋势，2周时出现下降，其余四组在相同时间点较NS组低，以MO2组最低;MP组在1天时达峰值，后缓慢下降。MO3在8小时达峰值，后下降。(4)IL-β和IL-6与TNF-α有类似的趋势，各时间点，都低于NS、MP组，P＜0.001。3、病理学观察:HE染色:在建模后8小时打击区下方广泛的出血、细胞水肿、固缩，以NS组最明显，MP组次之，在麝香酮所处理的3个组中，MO2出血较少，其余两个组仍较多。打击区下方与中央管间出现了空洞，随着时间的推移，出血减少，脊髓组织出现了坏死、溶解，星形胶质细胞增生，1周时显著增加，2周时达顶峰，后缓慢下降持续，在4周时NS组空洞扩大，中央管消失，MP组仍见散在的小空洞，部分为胶质细胞增生充填，3个剂量麝香酮所处理的脊髓空洞基本消失，MO2炎症反应最轻。尼氏染色:8小时NS组出现较多的胶质细胞，尼氏小体肿大明显、碎裂、分布不均，神经元缩小;MP组尼氏小体肿、聚积，神经元缩小，仍较完整;在麝香酮所处理的3个组中，MO2组神经元较多，形态较正常，尼氏小体分布正常，胶质细胞增生少。随着时间的推移，NS组胶质细胞增生，神经元固缩，核碎裂，结构消失，取而代之的是增生的胶质细胞，4周时见少量残存神经元，固缩明显。在同一时间点麝香酮所处理的3个组中，MO2组神经元数量较多，结核较完整，仍减少，卫星现象不明显，MO1、MO3组及MP组的神经元损伤介于生理盐水组与MO2组间，卫星现象明显。脊髓后侧角、损伤区出现类似的变化。GFAP染色:NS组1周时胶质细胞增生明显，2周时达顶峰，为155.8/视野，后缓慢下降，4周时102.2/视野，MP组明显低于NS组，在1周时达峰值125.8个/视野，后缓慢下降，4周91.8/视野，麝香酮处理的3组胶质细胞增呈下降趋势，在2周出现轻度上升，同一时间点低于NS组和MP组，以MO2最低，4周时47.4/视野。Western-Blot检测提示NS组caspase3、GFAP最高，Bcl-2最低，MO3组caspase3、GFAP最低，Bcl-2最高、其余各组在这两者之间。NS、MP组与MO组各时间点比较有显著性差异(P＜0.05)。采用BBB评分:5个实验组术后第1、3天，双下肢功能无明显变化，多处0-1级，双下肢功能逐渐改善，NS组在4周时达8.2，MP组达13.6，麝香酮处理后三组改善明显优于MP组和NS组，MO2组恢复最明显，在2周时达10.0，4周时达18.6。1d、3d时，P＞0.05，无统计学意义;1w时，P＜0.05，NS组与MO1组、MO2组、MO3组有显著性差异;2w时P＜0.05，MP组与MO1组比较无统计学意义，其余各组间两两比较有显著性差异;3w时P＜0.05，NS组、MP组与其余3组间比较有显著性差异;4w时P＜0.05，NS组、MP组与其余3组间比较有显著性差异。
　　结论：
　　不同浓度的麝香酮对大鼠急性脊髓损伤通过抑制免疫炎症反应，下调了caspase3的表达，上调了bcl-2的表达，减轻了神经细胞的坏死和凋亡，降低GFAP的表达，抑制了星形胶质细胞的过度增生，改善了急性脊髓损伤后双下的功能，以5mg/kg剂量效果显著，并优于甲强龙。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

参考文献

第一部分 麝香酮对原代脊髓星形胶质细胞损伤的保护性实验研究

1 材料

2 方法与步骤

3 结果

4 讨论

5 附图

参考文献

第二部分 麝香酮对原代脊髓星形胶质细胞物理化学损伤的机制探讨

1 材料

2 方法与步骤

3 结果

4 讨论

5 附图

参考文献

第三部分 麝香酮对急性脊髓损伤的保护实验研究

1 材料

2 方法与步骤

3 结果

4 讨论

5 附图

参考文献

全文总结

文献综述 脊髓损伤的病理改变及中药治疗

致谢

攻读学位期间撰写或发表的论文情况