肺炎链球菌组氨酸激酶(VicK)中药单体抑制剂的抗菌作用研究

摘要

目的：
　　双组份系统VicR/VicK是肺炎链球菌中唯一一个与细菌生存相关的TCS系统，调控着维持细胞壁稳态的基因表达，而且调节细菌对抗生素的耐药性。其中VicK为含449个氨基酸的组氨酸激酶受体，负责接收外界信号刺激并将信号传递给VicR，被认为是筛选抗菌药物的良好作用靶点。
　　目前已有多篇以VicK为靶点筛选抗菌药物的文章报道，本课题组以前也以该靶点筛选出6个具有抗肺炎链球菌作用的小分子化合物。而中药单体作为我国传统药物，来源广泛且副作用小，是很好的抗菌药物筛选库，实验室前期以肺炎链球菌VicK为靶点通过计算机虚拟筛选获得96种中药单体，本研究将对这些化合物的抗菌作用进行体内外验证，同时对其相关作用机制进行初步研究。
　　方法：
　　通过原核表达技术从大肠杆菌中表达S.pn VicK全长蛋白，经Western blot分析VicK在6种不同血清型肺炎链球菌中的保守性并通过试剂盒检测其激酶活性。然后利用具有活性的VicK蛋白对化合物进行体外筛选，以抑制VicK蛋白激酶活性的化合物进行随后的抑菌实验。采用最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)评估化合物的体外抗菌，利用细胞毒性试验评价其细胞毒性，采用小鼠S.pn鼻咽部定植模型和败血症模型评估化合物体内抗菌作用，分别以感染部位细菌载量和生存率为评价指标。采用微量棋盘稀释法检测其与传统抗菌药是否具有协同效应，并从细菌形态变化和生物膜形成的角度初步探索其抗菌的机制。
　　结果：
　　试验中的5种中药单体化合物为:甲硫腺苷、octanal2，4-dinitrophenylhydrazone、去氧紫草素、麻醉椒苦素、没食子酸月桂酯，其对VicK的ATPase酶活性具有显著的抑制效应，抑制率均大于50％。体外抑菌作用结果显示，这5中化合物对肺炎链球菌的MIC分别为37.1，38.5，17，68.5，and21μg/mL，而体内抗菌实验结果显示，5种化合物均能显著延长感染小鼠的生存时间。同时这5种化合物对耐药性肺炎链球菌、变形链球菌、缓症链球菌、化脓链球菌假肺炎均具有抗菌作用，其中去氧紫草素和没食子酸月桂酯对MRSA也有显著抗菌作用。抗菌机制研究实验结果显示，在sub-MIC下，5种化合物都能抑制细菌细胞分裂和生物膜的形成。传统抗菌药增效实验结果显示，去氧紫草素和没食子酸月桂酯与青霉素、红霉素和四环素都有协同作用，能够降低耐药型19F、19A S.pn在鼻咽部和肺部的定植。细胞毒性试验显示5种化合物的细胞毒性较低。
　　结论：
　　5种中药单体化合物为VicK蛋白抑制剂，具有显著的体内外抗链球菌的活性，且对青霉素、红霉素和四环素都有一定的增效作用，为新的具有一定广谱性的抗菌先导化合物，在治疗链球菌感染特别是耐药性链球菌感染中有一定的应用前景。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

第一部分 肺炎链球菌组氨酸激酶VicK蛋白的全长表达及其保守性分析

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第二部分 中药单体对VicK蛋白激酶活性的抑制作用及抗菌作用验证

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第三部分 VicK抑制剂的抗菌机制及对传统抗菌药的增效作用研究

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

全文总结

参考文献

文献综述 肺炎链球菌耐药性的研究现状及双组份系统对耐药的影响

致谢

攻读学位期间发表的学术论文题录