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肺炎链球菌组氨酸激酶VicK的全长表达及其保守性分析

摘要

目的:全长表达肺炎链球菌VicK蛋白并制备其多克隆抗体,从而对其进行保守性分析和亚细胞定位,为其作为抗菌药物筛选靶点提供实验依据.方法:利用PCR技术扩增肺炎链球菌D39菌株的VicK基因,将其克隆到原核表达载体PET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL21(DE3)中进行表达,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,通过Kinase-GIo(R)激酶发光检测试剂盒检测其激酶活性,利用纯化的VicK蛋白免疫BALB/C小鼠制备多克隆抗体,并用ELISA和Western印迹方法分别检测其多克隆抗体的效价及特异性.最后采用流式细胞仪检测技术和ELISA法对VicK蛋白进行表面定位.结果:从大肠埃希菌中成功诱导表达出VicK全长蛋白,纯化后的酶活性检测显示该蛋白具有水解A下户的酶活性。全长VicK蛋白免疫小鼠获得其抗血清,利用ELISA检测其效价达1:125000以上,Western Bfot结果显示其能特异地识别肺炎链球菌VicK。全菌蛋白的Western Blot结果显示Vick在1型、2型、3型、4型、6B及19F型肺炎链球菌中都有表达。流式结果表明在肺炎链球菌中VicK蛋白主要位于细菌胞内。结论:全长表达的VicK蛋白具有激酶活性,VicK在肺炎链球菌中保守表达,且蛋白分子主要位于胞内。

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