人脂肪干细胞成软骨诱导分化过程中MicroRNA的表达及细胞载体复合物软骨诱导培养的研究

摘要

第一部分人脂肪干细胞体外培养及细胞载体复合物诱导培养的研究
　　目的：探讨人脂肪干细胞体外培养方法以及对细胞载体复合物诱导成软骨分化的研究。
　　方法：通过选择性吸脂或其他腹部手术获取3个样品的脂肪组织，分离、消化获取人脂肪间充质干细胞（hADSCs），并经过原代和传代培养；MTT法检测细胞生长情况并绘制hADSCs的生长曲线；收集第3代hADSCs，利用流式细胞术检测hADSCs细胞表面分子标志（CD29、CD34、CD45、CD90和CD105）；hADSCs成脂诱导分化并使用油红O染色法鉴定，hADSCs成骨诱导分化并使用免疫荧光检测骨唾液酸蛋白（BSP）、骨桥蛋白（OPN）、骨连接蛋白（ON）的表达，利用阿利新蓝染色和免疫组化检测Ⅱ型胶原蛋白的表达正式 hADSCs的成软骨诱导分化作用；将第3代hADSCs与不同浓度胶原纤维蛋白溶液混合制成细胞载体复合物凝胶，14d后进行阿利新蓝染色以及免疫组化检测Ⅱ型胶原蛋白表达。
　　结果：体外分离、培养出高活性 hADSCs，增值曲线呈 S形。细胞CD29、CD90、CD105呈阳性表达，CD34、CD45呈阴性表达。hADSCs经成脂诱导后，细胞呈类圆形，细胞浆内出现有透亮的脂滴，油红 O染色色脂滴呈鲜红色。成骨诱导后细胞呈为不规则形，免疫荧光检测细胞表达骨唾液酸蛋白、骨桥蛋白、骨连接蛋白。hADSCs成软骨诱导后细胞形态变为铺路石样，阿利新蓝染色细胞基质呈蓝色，免疫组化检测Ⅱ型胶原蛋白染色呈阳性。阿利新蓝染色细胞载体复合物成蓝色，免疫组化检测Ⅱ型胶原蛋白结果显示，混合胶原蛋白组较单一胶原蛋白组更强阳性表达。
　　结论：成功分离培养出高度同源性hADSCs，具有多分化潜能。胶原纤维蛋白复合的支架载体，通过混合培养诱导 hADSCs成软骨细胞分化，可以作为修复软骨缺损的理想载体支架材料。
　　第二部分人脂肪干细胞软骨分化过程中MicroRNA的表达
　　目的：检测人脂肪干细胞向软骨细胞分化过程中的 MicroRNA（miRNA或者miR）表达谱，并确认该过程中MicroRNA影响软骨分化的潜在机制。
　　方法：（1）通过选择性吸脂或其他腹部手术获取3个样品的脂肪组织，分离和培养人脂肪干细胞（hADSCs）；（2）利用流式细胞仪检测hADSCs表面标记物（CD29、CD44、CD49和CD45）；（3）hADSCs经过成软骨诱导后分化，免疫组化检测软骨细胞相关蛋白的表达；（4）然后通过MicroRNA列阵获得MicroRNA表达谱，筛选出20个miRNAs具有至少2倍的差异性表达，这些miRNA包括12上调miRNAs和8下调miRNAs。Northern印迹分析进一步证实了miRNAs的表达水平，并通过 Northern印迹分析加以证实；（5）利用 TargetScan（ www.targetscan.org）、MiRanda（ www.microrna.org）和 miRBase（microrna.sanger.ac.uk）等算法预测 miRNAs的假定靶基因，并利用Western印迹分析检测所预知靶基因，荧光素酶报告基因分析加以证实；（6）利用功能分析来检测在 hADSCs向软骨细胞诱导分化中miR-196a和miR-490-5p的作用。用miR-490-5p慢病毒转染这些细胞，并用ELISA量化测定软骨细胞诱导分化标志物（Col2A1, Col10A1 and aggrecan）的表达；（7）用BMPR2 siRNA慢病毒转染hADSCs，并经过向软骨细胞诱导分化孵育后，Western印迹分析检测BMPR2蛋白的表达。ELISA量化测定软骨细胞诱导分化标志物（Col2A1, Col10A1 and aggrecan）的表达。
　　结果：（1）第3代hADSCs是包括小的，单个圆形或几个成团悬浮在培养基中，经过流式细胞仪检测细胞表面标记物：细胞阳性表达CD29，CD44和CD49，阴性表达CD45；（2）hADSCs经软骨诱导培养后细胞形态呈多边形（这是软骨细胞典型的形态学特征），利用免疫组化染色发现Ⅱ型胶原蛋白表达明显升高，证明 hADSCs向软骨细胞分化；（3）利用miRNA微阵列芯片进行检测3组样品的hADSCs经过软骨诱导分化前、后的hADSCs的miRNA的表达水平，软骨诱导分化前、后差异表达至少2倍的hADSCs的miRNA，包括12个上调miRNA（miR-196a，miR-143，miR-383，miR-193b，miR-7i，miR-26a，miR-539， miR-199a-3p，miR-337-5p，miR-146a-5p，miR-646和 miR-381）和8个下调 miRNA（ miR-490-5p， miR-1307， miR-125b， miR-96-3p， miR-302-3p，miR-23a-3p，miR-590和 miR-510）。（4）使用 Northern印迹分析检测8个已利用微列阵证实了，具有代表性差异性表达的miRNAs，包括4个上调的 miRNAs（miR-196a，miR-193b，miR-383和miR-143）和4个下调的miRNAs（miR-490-5p，miR-1307，miR-125b和miR-590）。Northern印迹分析显示miR-196a在3个样品中均过表达， miR-490-5p在3个样品中均明显下调。（5）我们利用功能分析来检测在 hADSCs向软骨细胞诱导分化中这2个 miRNAs（miR-490-5p和miR-196a）的作用。然而，我们仅发现miR-490-5p在软骨诱导分化过程中具有明显的作用，miR?196a却没有（数据未表明）。但是，在分化的第12天，用 miR-490-5p慢病毒转染这些细胞，与对照慢病毒组比较，到第18天时细胞形态学发生逆转。我们使用ELISA量化测定软骨细胞诱导分化标志物（Col2A1, Col10A1 and aggrecan），在第12天，第15天和第18天，细胞表面标记物的水平逐渐上调；但是，经过miR-490-5p慢病毒转染的细胞，这些标志物表达下调。这些结果表明miR-490-5p抑制hADSCs向软骨细胞分化。（6）生物信息学分析证实了SOX-2和BMPR2作为miR-490-5p的假定的靶基因，与软骨细胞分化有关。利用 Western印迹分析检测所预知靶基因 SOX-2和 BMPR2的蛋白表达，结果表明经过软骨细胞诱导分化的 hADSCs，其 SOX-2和 BMPR2的表达水平上调；将这些诱导分化后的 hADSCs用miR-490-5p慢病毒转染后，其BMPR2的表达水平下调，而SOX-2的表达并未受到明显影响。荧光素酶报告分析证实了 miR-490-5p抑制BMPR23'UTR萤光素酶40％的活性，而用突变的BMPR23'UTR转染后，荧光素酶活性被完全逆转。这些结果说明BMPR2是的miR-490-5p的直接靶标。（7）用BMPR2 siRNA慢病毒转染hADSCs，并经过向软骨细胞诱导分化孵育后，免疫组化检测表明BMPR2蛋白表达以时间依赖的方式显著下降，其Ⅱ型胶原蛋白表达下调；ELISA分析发现 Col2A1、Col10A1和aggrecan的表达水平在第12天，第15天和第18天均下调。
　　结论：我们证实了一组在调节 hADSCs向软骨细胞分化的过程中起关键作用的 miRNA。我们的研究结果为进一步研究在hADSC软骨形成过程中发挥作用的miRNAs的分子机制奠定了基础。

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中文摘要

前言

第一部分 人脂肪干细胞体外培养及细胞载体复合物诱导培养的研究

1．材料与方法

2.结果

3. 讨论

4.小结

第二部分 人脂肪干细胞软骨分化过程中MicroRNA的表达

1.材料与方法

2. 结果

3. 讨论

4.小结

参考文献

全文总结

文献综述: 脂肪干细胞的生物学特性及在骨、软骨组织工程中的研究进展

致谢

攻读学位期间的主要研究成果