DLL1在BMP9诱导MSCs成骨分化的作用及机制研究

摘要

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs）是成体干细胞中的一种，具有多项分化潜能和较强的自我更新能力，同时又因为其具有易于分离培养和取材方便等特点，因此可作为骨科疾病治疗、修复受损骨以及组织工程中完美的再生细胞。骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）具有能够诱导MSCs向成骨分化的能力，其中BMP9是目前研究发现诱导成骨能力最强。Notch信号通路广泛存在于脊椎动物和非脊椎动物等多种动物体内，是一条保守的信号通路，在生物胚胎期以及出生后的整个发育过程中都发挥着重要调控作用。对多种细胞系的增殖、分化、凋亡、粘附以及表皮细胞向间质转化都有一定调控作用。有研究证实，在MSCs成骨分化过程，Notch信号通路参与了调控作用。课题组前期研究证明，Notch信号通路能够促进BMP9诱导MSCs向成骨分化，但具体机制尚未明确。DLL1是Notch信号通路的一种配体，目前有研究报道，在胶质瘤中，DLL1可能通过阻滞细胞分化来促进细胞增殖；但在黑色素瘤中，DLL1能够调节胚胎动静脉分化以及成体损伤后的血管再生与修复。但目前还没有研究报道DLL1对成骨分化作用的具体影响与机制。
　　第一部分实验主要研究目的：探究DLL1在BMP9诱导MSCs向成骨分化的作用；研究发现DLL1促进BMP9诱导的MSCs成骨分化；在这个过程中，DLL1明显上调BMP9的受体ALK2表达，而BMP9其余受体并没有明显变化；同时，我们发现Notch信号通路抑制剂DAPT和dnNotch1作用后都出现同样的调节ALK2表达的现象。因此，我们在第二部分着重研究，Notch信号通路是否通过上调ALK2影响BMP9诱导MSCs的成骨分化。
　　第一部分DLL1在BMP9诱导MSCs成骨分化中的作用
　　目的：了解Notch配体Delta-like1(DLL1)在BMP9诱导的MSCs成骨分化的作用及可能机制。方法：采用重组腺病毒分别上调BMP9，及DLL1，采用细胞化学染色分别检测早期成骨指标碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和晚期成骨指标茜素红染色，了解DLL1在体外对BMP9诱导的成骨分化的影响；同时，通过裸鼠异位成骨实验，mcroCT和HE染色，分析DLL1在体内对BMP9诱导成骨分化的作用。另一方面，qRT-PCR检测BMP9受体的表达情况，Western检测p-Smad1/5/9和荧光素报告酶检测Smad结合元件（Smad-binding element，SBE）活性，分别从胞膜、胞浆和胞核三个水平了解DLL1对BMP9信号通路的影响，以了解DLL1促进BMP9诱导成骨分化的可能机制。结果：DLL1处理组与对照组相比，前者在体外能明显促进BMP9诱导的MSCs的ALP及钙盐沉积；在体内亦能促进裸鼠皮下成骨；在这一过程中，DLL1处理后，BMP9的受体ALK2明显上调；Smad1/5/8蛋白总量没有改变，p-Smad1/5/9蛋白表达水平升高，而SBE活性也有升高（P＜0.05）。
　　结论：DLL1在体内外都能够促进BMP9诱导MSCs成骨能力；在细胞膜、细胞浆及细胞核三个水平，对BMP9-Smad经典信号通路都有作用。
　　第二部分Notch信号通路通过上调ALK2促进BMP9诱导MSCs成骨分化
　　目的：了解Notch信号通路是否是通过上调BMP9受体ALK2促进BMP9诱导的MSCs成骨分化作用。
　　方法：分别采用重组腺病毒DLL1和BMP9上调Notch和BMP9，DAPT和重组腺病毒dnNotch1下调Notch，重组腺病毒siALK1和2下调ALK1和ALK2。分组处理MSCs细胞后，RT-PCR/qRT-PCR检测受体表达情况；细胞化学法检测早晚期成骨指标；流式细胞术检测细胞周期以及凋亡情况；Edu检测细胞增殖。
　　结果：BMP9诱导成骨过程中，上调/下调Notch，能引起ALK2，而不是ALK1表达量的变化；DLL1能逆转由于干扰ALK2导致的早晚期成骨分化指标的减弱，但对siALK1处理组没有影响；流式细胞分析和Edu实验显示DLL1能逆转由于干扰ALK2导致的减少的细胞增殖（P＜0.05），而对siALK1处理组没有影响；但对细胞凋亡并无明显影响。
　　结论：在BMP9诱导的成骨分化过程中，Notch信号通路可能通过上调 ALK2的表达，影响细胞增殖，从而促进MSCs成骨分化。

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中文摘要

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技术路线：

前言

第一部分DLL1在BMP9诱导的MSCs成骨分化中的的作用

1材料与方法

1.1 材料

1.2 实验方法

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 DLL1对BMP9诱导MSCs成骨分化的作用（现象）

2.2 DLL1促进BMP9诱导MSCs成骨作用机制研究

3 讨论

第二部分Notch信号通路通过上调ALK2促进BMP9诱导MSCs成骨分化

1材料与方法

1.1细胞、主要试剂及仪器

1.2 实验方法

2 结果

2.1 BMP9诱导MSCs成骨分化过程中，Notch信号通路对BMP9受体表达的影响

2.2 Notch信号对siALK1和siALK2处理后BMP9诱导的MSCs早晚成骨分化的影响

2.3 Notch信号对siALK1和siALK2处理后BMP9诱导的MSCs细胞周期的影响

2.4 Notch信号对siALK1和siALK2处理后BMP9诱导的MSCs细胞凋亡的影响

2.5 Notch信号对siALK1和siALK2处理后BMP9诱导的MSCs细胞增殖的影响

3 讨论

全文总结

文献综述: Notch信号与ALK2在MSCs成骨分化中作用

致谢

硕士在读期间发表的学术论文