TRPC3参与糖氧剥夺致培养的少突胶质细胞凋亡

摘要

背景：
　　随着社会人口老龄化，神经退行性疾病的发病率日益增高，而临床上，对于这类疾病尚无有效控制病程进展的措施。瑞士研究者发现神经系统退行性疾病与髓鞘脱失有关，进一步研究证明少突胶质细胞退化导致脱髓鞘，少突胶质细胞对缺血缺氧损伤较其他胶质细胞敏感，在大脑的某些特定区域甚至比神经元对缺血缺氧损伤更敏感。因此，有学者提出少突胶质细胞的缺血缺氧损伤是神经退行性疾病重要原因。
　　钙离子是调节各个流程的通用第二信使，是细胞间信号传递的关键离子，钙稳态紊乱是缺氧缺血后神经细胞死亡诸多途径的共同节点。介导外钙内流主要有：电压依赖的和非电压依赖的钙通道两种方式，瞬时受体电位通道蛋白(transient receptor potential channel，TRPC)是一类非电压依赖跨膜蛋白，是维持Ca2+稳态的重要离子通道。TRPC在中枢神经系统表达广泛，参与了神经系统很多重要的生理功能，其中TRPC3在中枢神经系统中表达最广泛。研究表明TRPC3异常激活可致神经退行性疾病，但是TRPC3是否参与缺血缺氧少突胶质细胞的损伤，目前并不清楚。
　　我们为研究TRPC3是否参与缺血缺氧少突胶质细胞的损伤，本实验体外培养少突胶质细胞，建立少突胶质细胞糖氧剥夺（oxygen glucose deprivation，OGD）模型，采用了TRPC3阻断剂Pyr3阻断OGD少突胶质细胞后，检测少突胶质细胞存活和凋亡的变化及细胞内钙离子浓度的改变。旨在探讨 TRPC3是否参与了糖氧剥夺少突胶质细胞凋亡，为神经退行性疾病的防治提供新的理论依据和可行的途径。
　　方法:
　　第一部分
　　1.取SD乳鼠脑皮质，采用两种不同的细胞增殖法和两种不同的分离纯化法分四组培养，A组为细胞因子增殖联合摇床震荡分离纯化法，B组为B104CM（the conditioned medium prepared from B104 neuroblastoma cells，B104CM）增殖联合摇床震荡分离纯化法，C组为细胞因子增殖联合EDTA消化机械吹打分离纯化法，D组为B104CM增殖联合EDTA消化机械吹打分离纯化法。倒置显微镜下观察神经细胞形态学变化并对各组细胞进行计数。
　　2.用A2B5和髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）检测其少突胶质细胞生物学特性并分析其纯度。
　　3.建立体外少突胶质细胞OGD损伤模型的方法:三气培养箱缺氧、无糖DMEM相结合的方法，即培养箱调整为（94％N2+5%CO2+1%O2)，培养基更换为无糖DMEM，分别培养1h，2h，3h后取出细胞，更换为正常少突胶质细胞培养基，恢复正常的培养条件继续培养，同时常氧常糖设置为正常对照。
　　4.细胞活力及凋亡改变的检测：OGD1h，2h，3h后，恢复正常条件复氧培养24h，MTT比色法测定细胞活力变化；Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞的凋亡率。比较1h，2h，3h对细胞的损伤程度，确定适合少突胶质细胞合适的OGD时间。
　　第二部分
　　1.建立体外少突胶质细胞OGD损伤模型：采用三气培养箱物理缺氧与DMEM缺糖相结合构建少突胶质细胞OGD损伤模型。
　　2.采用蛋白质免疫印迹法检测OGD损伤模型少突胶质细胞TRPC3蛋白的表达变化。
　　3.实验分组：以原代培养的新生SD大鼠少突胶质细胞为对照组，以OGD少突胶质细胞为模型组，将模型组+Pyr3阻断组设为处理组。
　　4.MTT检测各组细胞活力，AnnexinV-FITC试剂盒染色后经流式细胞仪检测各组细胞凋亡。
　　5.fluo-3染色后经流式细胞仪和激光共聚焦显微镜测定各组细胞内游离钙的变化。
　　结果:
　　1.B104CM增殖联合EDTA消化机械吹打分离纯化法较其他三种培养方法收获的OPC数量多。
　　2.少突胶质细胞A2B5和MBP特异性标记，细胞纯度可达到95%。
　　3.MTT结果显示，OGD1h少突胶质细胞细胞活力即降低，随着缺氧时间延长细胞活力呈降低的趋势。流式细胞测细胞凋亡的结果表明
　　OGD1h、2h、3h，细胞早期凋亡率分别为（14.43±0.20）%、（21.99±0.42）%、(44.71±0.20）%，与正常对照组（6.86±0.05）％相比，均有统计学意义（P＜0.05）。
　　4.OGD损伤模型少突胶质细胞TRPC3蛋白表达增加。
　　5.OGD组细胞活性为（54.34±6.55）%，凋亡率为（24.24±0.86）%，与对照组有显著差异(P＜0.05)，Pyr3处理组细胞存活率为（72.26±5.41）%，凋亡率为（14.82±0.28）%，与OGD组有显著差异(P＜0.05)。
　　6.激光共聚焦测钙离子浓度结果显示，正常对照组荧光强度为（28.89±4.43）%，OGD组荧光强度为（58.05±5.80）%、处理组荧光强度为（42.26±5.44）%，差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞技术测定细胞内钙离子浓度结果显示，正常对照组荧光强度为（4.15±0.65）%，OGD组荧光强度为（23.99±1.22）%，处理组荧光强度为（10.54±0.73）%，差异有统计学意义(P<0.05)。两组结果均显示，OGD组细胞内钙水平升高，而加入TRPC3阻断剂Pyr3后，胞内钙增加得到显著抑制。
　　结论:
　　1.B104CM增殖联合EDTA消化机械吹打分离纯化培养法简单可行，具有稳定的可重复性，可用于少突胶质细胞的培养。
　　2.采用三气培养箱物理缺氧与DMEM缺糖相结合可有效的构建少突胶质细胞OGD损伤模型。OGD2h可能是少突胶质细胞OGD模型的合适时间，此模型可用于少突胶细胞实验的体外实验研究。
　　3.TRPC3表达增加介导胞内游离钙离子水平的升高可能是OGD少突胶质细胞凋亡的重要原因之一。

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封面

目录

英汉缩略语名词对照

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分 大鼠少突胶质细胞体外培养与其OGD模型的构建

前言

材料

1.1动物

1.2B104细胞株

1.3试剂

1.4主要仪器

方法

2.1B104细胞株培养

2.2B104CM的收集和存储

2.3实验动物解剖

2.4少突胶质细胞前体细胞原代培养及分离纯化

2.5倒置显微镜观察细胞形态并采图及细胞计数

2.6免疫荧光染色

2.7构建OGD模型

2.8 MTT比色法检测细胞活力

2.9 流式细胞技术检测细胞凋亡

2.10 统计学分析

结果

3.1 B104正常培养细胞形态及收集上清液时细胞形态

3.2 神经胶质细胞生长情况

3.3 少突胶质细胞免疫荧光鉴定和观察

3.4 四种方法收获的单细胞数量的比较

3.5缺氧对少突胶质细胞细胞活力的影响

3.6流式测细胞凋亡结果

讨论

参考文献

第二部分 TRPC3参与糖氧剥夺致培养的少突胶质细胞凋亡

前言

材料与方法

1.1 主要试剂

1.2主要试剂的配制

1.3动物与细胞株

1.4少突胶质细胞原代培养

1.5OGD模型构建

1.6Western boltting检测少突胶质细胞中 Beta-catenin、TRPC3蛋白

1.7MTT比色法检测细胞活力

1.8流式细胞技术检测细胞凋亡

1.9激光共聚焦扫描显微镜技术测定细胞内钙离子浓度

1.10流式细胞技术测定细胞内钙离子浓度

1.11统计学分析

结果

2.1 OGD模型少突胶质细胞TRPC3表达的变化

2.2 流式细胞技术测少突胶质细胞凋亡率

2.3细胞内钙离子浓度变化

讨论

参考文献

文献综述:瞬时受体电位通道蛋白与中枢神经系统疾病

图片

致谢

硕士期间发表的论文