GPER介导他莫昔芬对人乳腺癌相关成纤维细胞的增殖、迁移及凋亡作用

摘要

目的：通过构建G蛋白偶联雌激素受体（GPER）的慢病毒短发夹RNA（shRNA）表达载体，探讨GPER介导他莫昔芬（tamoxifen，TAM）对人乳腺癌相关成纤维细胞（Cancer-associated fibroblast, CAF）的细胞增殖、迁移与凋亡作用1。
　　方法：1.设计4条长度为19 bp的针对GPER基因shRNA的寡核苷酸序列及阴性对照序列，合成相应的siRNA序列。将GV115载体用Age I和EcoR I行双酶切，将酶切产物和合成的成对的寡链氨基酸退火形成双链DNA结构混合，通过T4 DNA连接酶连接，用大肠杆菌感受态细胞转化后挑取转化子，使用GV115载体通用引物，进行菌落PCR及测序鉴定，在HEK293T细胞中包装病毒及测定病毒滴度。通过实时定量PCR进行内源性筛靶，选取干扰效果最佳的病毒进行后续实验， Western blot法检测慢病毒在靶细胞的蛋白表达。
　　2.将CAF细胞分为4组，NC(negative control,NC)组、GPER-RNAi、NC联合TAM组和GPER-RNAi联合TAM组，CCK-8检测法、流式细胞术及Transwell实验检测经他莫昔芬处理后各组CAF细胞的增殖、迁移及凋亡能力。
　　结果：1.Lenti-GPER-siRNA慢病毒载体经HEK293T细胞包装成功， Western blot结果显示转入病毒后GPER在CAF细胞中的表达较NC组显著降低（P<0.05）。
　　2.流式细胞术及CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况。各组PI分别为(30.76±7.4)％，(32.54±3.5)%，(43.61±4.4)%(P=0)，(34.93±6.8)%。TAM处理72h后，NC联合TAM组细胞数增加至NC组的(172.16±10.8)%(P=0)。GPER-RNAi组细胞数为NC组的(92.73±7.1%(P=0.10)， GPER-RNAi联合 TAM组(96.58±4.2)%(P=0.43)。流式细胞术检测 NC组、GPER-RNAi组、NC联合TAM组和GPER-RNAi联合NC组细胞凋亡比率分别为：(29.10±1.4)%、(28.27±1.3)%、(9.62±0.91)%、(31.09±1.2)%。GPER-RNAi组细胞凋亡比率与NC组无明显差异P>0.05，。NC联合TAM组凋亡低于对照组(P<0.05)。Transwell实验提示加入TAM后， CAF迁移细胞数明显增加(迁移细胞数由40.75±3.59个增加至99.50±4.80个)，而GPER-RNAi联合TAM组则无明显变化。
　　结论：成功构建Lenti-GPER-siRNA慢病毒载体，感染CAF后可有效沉默GPER表达；TAM通过GPER促进CAF细胞增殖并抑制其细胞凋亡。

目录

封面

目录

英汉缩略语名词对照

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分GPER-RNAi慢病毒载体构建及鉴定

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 阳性克隆的PCR鉴定

2.2 慢病毒包装及滴度鉴定

2.3 有效靶点的筛选

2.4 重组慢病毒GPER-RNAi转染CAF中GPER水平降低

3 讨论

第二部分GPER介导TAM对CAF的细胞增殖、迁移及凋亡的作用

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 TAM通过GPER促进CAF细胞增殖

2.2 TAM通过GPER抑制CAF凋亡

2.3 TAM通过GPER促进细胞迁移

3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述:雌激素受体GPER的研究进展

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文