斑马鱼牙齿再生模型的构建及其初步研究

摘要

牙齿是消化系统的重要组成部分，此外还兼顾发音和美观功能。牙齿缺失是先天或后天因素导致的牙齿发育障碍或脱落，该疾病虽不致命但会严重影响人们的生活质量。除了乳恒牙替换阶段，一旦牙齿缺失将无法自行修复再生。传统的修复方式虽然能恢复部分牙齿形态和功能，但是和天然牙齿相比仍存在着较大的差距。近些年来随着人们对牙齿的自我保健意识的增强，“第三副牙齿”已成为人们殷切的期盼。牙齿再生因重要的医学价值而成为研究的热点。
　　目前，牙齿发育及再生的首选模式动物多局限于小鼠等哺乳动物，近年的研究使我们对牙齿的早期发育、组织分化及器官的构建有一定程度的了解。然而哺乳类模式生物有着自身的局限性，其胚胎发育和分化过程中所涉及的调控机制难以获得深入研究。斑马鱼具有深入探究机体发育调控分子机制的独特优势，是研究牙齿发育和再生的新兴模式生物。
　　特异性损伤模型主要基于Mtz/NTR系统。通过构建重组转基因系，使细胞特异性表达硝基还原酶（NTR）。Mtz/NTR系统特异性损伤的原理是特异性表达 NTR的组织在甲硝哒唑（Mtz）作用下，NTR被NADH或NADPH还原后与Mtz结合，将无毒性的Mtz转化为有细胞毒性的代谢物，从而特异性导致表达NTR的细胞死亡。
　　目的：构建斑马鱼器官模型，利用Mtz/NTR系统造成牙胚特异性损伤，观测损伤后有无再生现象，为后期前体细胞的定位追踪提供条件。
　　方法：本实验首先构建 pBluescriptⅡ-dlx2b-Dendra2-NTR重组质粒将斑马鱼牙胚的特异性启动子 dlx2b连接到 Dendra2-NTR的上游，从而使牙胚细胞能够特异性表达细菌的硝基还原酶（NTR）并呈现绿色荧光。运用显微注射技术向单细胞期的斑马鱼胚胎动物极内注射重组质粒，重组质粒将随机整合到斑马鱼基因组内，经数代繁育筛选获得能够稳定遗传的dlx2b:Dendra2-NTR转基因斑马鱼系。利用Mtz/NTR系统对其造成牙胚特异性损伤。
　　结果：本实验成功构建了斑马鱼牙胚特异性定位损伤模型。选用72hpf-96hpf时期的dlx2b：Dendra2-NTR转基因斑马鱼作为Mtz作用起始时间点，经验证用12mM Mtz处理24小时后，相比对照组，实验组的胚胎牙胚荧光明显减弱，继续处理达48小时后，运用激光共聚焦显微镜未发现残存牙胚细胞。撤去Mtz，经过48小时的恢复可看到明显的牙齿再生现象。
　　结论：实验证明所建立的dlx2b: Dendra2 NTR转基因斑马鱼系能够特异性损伤牙胚，撤除药物后损伤的牙胚能够再生。可用于牙齿再生过程中细胞来源的定位追踪和相关分子机理机制的探索。

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英文摘要

前言

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2实验方法

2 结果

2.1 pBluescript II-KS-dlx2b-Dendra2-NTR的构建

2.2 斑马鱼胚胎注射转基因质粒结果

2.3 Mtz/NTR系统特异性介导斑马鱼牙齿的损伤

2.4 Mtz/NTR系统特异性介导斑马鱼牙胚损伤后可以再生

2.5 撤去Mtz后斑马鱼损伤牙胚的再生存在差异

3 讨论

3.1 斑马鱼牙齿特异性损伤模型的建立

3.2 损伤时间和损伤模式的选择

3.3 损伤后斑马鱼牙齿再生差异的分析

3.4 斑马鱼牙胚再生来源的来源猜测

3.5 进一步的研究方向

全文总结

参考文献

文献综述: 模式生物斑马鱼在牙齿发育和再生领域的研究进展

致谢

硕士期间发表的论文