日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗的构建及其诱导BALB/c鼠免疫应答的动态研究

摘要

目的：日本血吸虫病属我国规划防治的严重寄生虫病之一，现有血吸虫病疫苗由于各种不足均未能应用于临床，因此，开发新型疫苗是预防该病的必经之路。本研究拟扩增日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)32抗原编码基因，以两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum,Bb)为“载体”，构建日本血吸虫重组 Bb(pGEX-Sj32)疫苗，并进一步观察该疫苗诱导BALB/c鼠免疫反应的动态变化，为日本血吸虫病的防治提供一种新型疫苗。
　　方法：
　　1.从本室保存的 BL21(pET28α-Sj32)重组菌中抽提质粒pET28α-Sj32，并以该质粒为模板，PCR扩增得到Sj32抗原编码基因，利用基因重组技术将此目的基因插入载体 pGEX-1λT，构建重组质粒pGEX-Sj32，以电穿孔法将其转化到Bb中，获得重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗；仍采用电穿孔法将 pGEX-Sj32转化至大肠埃希菌(Escherichia coli，E.coli)BL21(DE3)中加 IPTG诱导表达，采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白印迹(Western blot)技术鉴定其表达产物。
　　2.将重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗分别经口服(Per os,PO)和滴鼻(Intranasal,IN)途径免疫BALB/c鼠，动态观察免疫后0~20周该疫苗所诱导的免疫应答变化，以常规ELISA法检测血清抗体IgG及其亚类、IgE和IgA水平，双抗体夹心ELISA法检测血清细胞因子及脾细胞培养液中细胞因子(TNF-α、IL-10和IL-12)的动态变化，四甲基偶氮唑盐比色法(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)分析免疫后不同时间点脾脏淋巴细胞增殖水平、流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测小鼠脾脏中T细胞(CD4+T和CD8+T)亚群分化和脾细胞凋亡率。
　　结果：
　　1.成功扩增出长度为1270 bp的Sj32抗原编码基因；双酶切证实质粒pGEX-1λT与Sj32基因重组成功；在重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗中PCR扩增出1270 bp的Sj32基因片段,与目的基因长度相符；重组质粒pGEX-Sj32可在大肠埃希菌中被IPTG诱导后的表达产物经SDS-PAGE电泳证实为相对分子质量约58 kDa的重组蛋白,以诱导后5~7h表达效率较高;Western blot显示该重组蛋白可被日本血吸虫感染的兔血清所识别。
　　2.动态研究表明：
　　（1）血清抗体及细胞因子 PO组血清抗体IgG及其亚类IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA均于8周达最高水平，而IN组除IgG2b和Ig3于12周、IgE于14周达较高水平外，其余均于8周达最高值；两组血清细胞因子IL-10、IL-12和TNF-α分别在免疫后(PO组)14、6和8周及(IN组)8、6和8周达最高水平；
　　（2）脾细胞增殖及细胞因子变化 PO组和IN组脾细胞增殖均于免疫后6周达最高值；分别于6周和8周达最大脾细胞凋亡发生率；脾CD4+T细胞亚群百分比分别在6周和8周达最高值，而两组CD8+T细胞亚群百分比在免疫后2~20周升高不显著，与0周相比无统计学差异；PO组脾细胞因子IL-10、IL-12和TNF-α水平均分别于免疫后10周、6周和8周达最大值，IN组分别在12周、8周和8周达最大值。
　　结论：
　　1.成功将目的基因Sj32与载体连接，得到重组质粒pGEX-Sj32，
　　2.pGEX-Sj32被成功引入Bb获得了日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗；
　　3.重组质粒在大肠埃希菌中能表达58 kDa的重组蛋白，且具有较强的免疫原性；
　　4.重组 Bb(pGEX-Sj32)疫苗能够诱导 BALB/c鼠产生有效的免疫应答。

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封面

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英汉缩略语名词对照

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英文摘要

前言

参考文献

第一章 日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗的构建及其表达效率的研究

第一节 日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗的构建及鉴定

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

参考文献

第二节 日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj32的大肠埃希菌BL21中的表达

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

参考文献

第二章 日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗诱导BALB/c小鼠免疫应答的动态研究

第一节 日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗诱导BALB/c小鼠血清抗体和细胞因子的动态研究

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

参考文献

第二节 日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗诱导BALB/c小鼠脾细胞增殖的动态变化

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

参考文献

第三节 日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗诱导BALB/c鼠脾脏T淋巴细胞亚群的动态研究

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

参考文献

第四节日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗诱导BALB/c鼠脾细胞因子的动态研究

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

参考文献

第五节日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗诱导BALB/c鼠脾细胞凋亡的动态研究

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

参考文献

全文小结

文献综述: 本血吸虫Sj14-3-3疫苗研究进展

致谢

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