低压低氧时细胞因子的变化特点及其与心肌纤维化的关系

摘要

心肌纤维化是以过度的细胞外基质沉积为特征，对组织进行纤维性修复，持续的心肌纤维化可导致心功能紊乱，是许多慢性心脏疾病的晚期共同病理过程。我国幅员辽阔的高原地区居住人群，常因长期吸入气体低压低氧导致肺动脉高压，引起右心室肥厚、心肌纤维化，并伴有炎症反应。慢性低压低氧引起的肺动脉压增高，心肌严重纤维化，使心肌组织的氧供需矛盾更加突出。近年研究发现，纤维细胞在组织纤维化发展过程中发挥重要作用。组织纤维化过程中有多种细胞因子的参与，转化生长因子（TGF-β）以及它下游信号分子结缔组织生长因子（CTGF）被认为是两个重要的促纤维化细胞因子。同时，炎症反应所释放的膜联蛋白A1（AnxA1）、凯萨琳相关抗菌肽（CRAMP），在组织纤维化过程中发挥不同的作用。但是在低压低氧过程中，心肌组织中纤维细胞的变化特点及其作用，TGF-β、CTGF、AnxA1、CRAMP的变化特点及其与心肌纤维化的关系，目前尚未见报道。
　　目的：
　　探讨低压低氧时纤维细胞以及细胞因子（TGF-β、CTGF、AnxA1、CRAMP）的变化特点及其与心肌纤维化的关系。
　　方法：
　　将50只雄性SD大鼠随机分为常压常氧饲养组（对照组）与低压低氧3、7、14和28 d饲养组，每组10只大鼠。低压低氧各组大鼠置于模拟海拔6000 m的低压舱内饲养。于相应时间点通过心导管检测大鼠平均肺动脉压（mPAP）、右室收缩压（RVSP）、心肌收缩力指数（dp/dtmax）；随后分别分离其大鼠右心室、左心室及室间隔，并检测其质量，然后计算右心室肥厚指数（RVHI）；通过HE染色观察大鼠右心室壁心肌结构变化；通过MASSON染色观察大鼠右心室壁组织胶原含量变化；用免疫荧光化学染色法观察右心室心肌组织中CD45与Ⅰ型前胶原双阳性的纤维细胞变化特点；通过荧光定量PCR法（RT2-PCR）检测右心室心肌组织中COL-Ⅰ、FPR1、TGF-β和CTGF的mRNA水平，并分析同组内TGF-β、CTGF mRNA水平与COL-ⅠmRNA水平、右心室肥厚指数的相关性；通过免疫印迹(WB)法分别检测右心室心肌组织中COL-Ⅰ、AnxA1、CRAMP、FPR、TGF-β和CTGF蛋白表达水平。H9c2心肌细胞置于常压常氧培养（对照组）与常压缺氧(1％,O2)培养6、12、24 h，采用RT2-PCR检测心肌细胞内AnxA1、TGF-β和CTGF的mRNA表达水平。
　　结果：
　　1.低压低氧对心脏血流动力学特性的影响
　　低压低氧组随时间延长，mPAP逐渐增加，低压低氧各组分别与对照组相比，其差异具有统计学意义（P＜0.05）；与对照组相比，对低压低氧时间延长，RVSP逐渐增加，在低压低氧暴露3、7、14和28 d组，显著增加，且差异具有统计学意义（P＜0.01）；+dp/dtmax在低压低氧14、28 d增加显著，与对照组相比，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。
　　2.低压低氧条件下右心室心肌组织结构改变
　　与对照组相比，随低压低氧时间延长，RVHI增加，在低压低氧暴露7、14和28 d组显著增加，且差异具有统计学意义（P＜0.05）；通过HE染色观察到，随低压低氧饲养时间延长，各组大鼠右室壁可见心肌细胞逐渐增粗，细胞排列较紊乱，尤其14 d和28 d组，细胞间纤维明显增多。
　　3. MASSON染色观察大鼠右心室中胶原含量变化
　　MASSON染色结果显示，与对照组相比，低压低氧各组心肌组织内胶原沉积明显增多，随时间增加而增加，低压低氧3d组即可见心肌组织内胶原沉积增多，低压低氧28 d组增加最显著。与对照组相比， COL-Ⅰ蛋白水平随低压低氧时间延长表达量增加，且低压低氧7、14、28 d组显著升高，其差异具有统计学意义（P＜0.05）；COL-ⅠmRNA水平随低压低氧时间延长表达量增加，且低压低氧3、7、14、28 d组显著升高，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。
　　4.免疫荧光化学染色观察大鼠右心室中纤维细胞变化特点
　　免疫荧光化学染色结果显示，在常氧组心肌组织中未发现双重染色的纤维细胞，在低压低氧3d组心肌组织中双重染色的纤维细胞明显增多，在低压低氧7、14和28 d组未发现双重染色的纤维细胞。
　　5.低压低氧条件下大鼠右心室心肌中细胞因子表达变化
　　与对照组相比，低压低氧3 d组右心室心肌组织中TGF-β、CTGF mRNA与蛋白表达量均显著升高（P＜0.05），低压低氧28 d组右心室心肌组织中TGF-β、CTGF蛋白水平均显著升高（P＜0.05），而低压低氧7、14 d组两细胞因子表达量与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与对照组相比，低压低氧3、28 d组右心室心肌组织中， FPR1 mRNA与FPR蛋白表达量均显著升高（P＜0.05），而低压低氧7、14 d组表达量与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与对照组相比，低压低氧3、7和14 d AnxA1蛋白含量均增加，且3 d增加最显著（P＜0.05），而低压低氧28 d表达量与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与对照组相比，低压低氧 CRAMP蛋白含量随低压低氧时间增加，且7、14和28 d组表达量显著升高，与对照组相比其差异具有统计学意义（P＜0.05）。
　　6.常压缺氧对培养的H9c2心肌细胞中细胞因子表达的影响
　　与对照组相比，TGF-β的mRNA水平随缺氧时间延长先增加后降低，且6 h组增加最显著，而缺氧6、12 h组表达量与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组相比， CTGF mRNA水平随常压缺氧时间延长而增加，且12、24 h组差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组相比， AnxA1的mRNA水平随缺氧时间延长先增加后降低，缺氧6 h组其差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　7. TGF-β、CTGF与心肌重塑、心肌纤维化之间的相关关系
　　对照组与低压低氧0、3、7和14 d组，COL-Ⅰ与RVHI水平呈显著正相关（P＜0.05），说明 COL-Ⅰ表达水平与右室肥大相关。以COL-Ⅰ反映心肌纤维化程度，分析两因子与纤维化的相关关系，发现低压低氧0、3、7和14 d组TGF-β与其呈显著正相关（P＜0.05）；低压低氧3、7 d组CTGF与其呈显著正相关（P＜0.05）。分析与RVHI的相关性时，发现低压低氧0、3、7、14组TGF-β与其呈显著正相关（P＜0.05），低压低氧3、7、14和28 d组与CTGF与其呈显著正相关（P＜0.05）。
　　结论：
　　低压低氧早期即可引起大鼠明显的心肌纤维化以及纤维细胞的浸润；随时间延长，心肌纤维化加剧；低压低氧早期促纤维化因子TGF-β与CTGF表达明显上调，随后回降，CTGF于28天再次增加，AnxA1在低压低氧早期显著增加，随后回降；CRAMP随着低压低氧时间延长而逐渐增加。低压低氧时心肌纤维化与TGF-β、CTGF有关。纤维细胞、TGF-β、CTGF有望成为缺氧心脏病诊断指标以及防治的靶点。

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中文摘要

英文摘要

前言

第一部分 低压低氧引起右心室心肌纤维化以及纤维细胞浸润的特点

前言

1 材料方法

2 实验结果

3 讨论

第二部分 低压低氧对心肌CTGF和TGF-β的影响及其与心肌纤维化的关系

前言

1 材料方法

2 实验结果

3 讨论

第三部分 低压低氧对心肌中甲酰肽受体激动剂的影响及其与心肌纤维化的关系

前言

1 材料方法

2 实验结果

3 讨论

全文结论

参考文献

文献综述: 纤维细胞在心脏纤维化中的作用

致谢

硕士期间发表文章