低压低氧时Th17细胞的变化特点及其与肺血管改建的关系

摘要

研究背景及目的:
　　HPH是一种低氧所引起的慢性进行性疾病，主要有持续肺动脉压力升高、并伴有右心室肥大及肺血管结构改建等特点。在高原心脏病(High Altitude Heart Disease，HAHD)发病的过程中HPH所扮演的角色非常关键。HAHD作为慢性高原病患者重要的死亡原因，也是高原上的常见疾病。因此，HPH及其发病机制的探索一直是高原医学研究的重点与热点。由于HPH的发病机制尚不完全清楚，迄今尚缺乏有效的预防及治疗措施。以往研究发现，HPH的发生发展中炎症免疫反应发挥有重要作用，但具体机制仍有待完善。
　　Th17细胞是一类具有强大的致炎性的细胞，有研究表明，其在炎症反应中发挥了重要作用。Th17细胞隶属于CD4+T辅助细胞系，作为一种CD4+T辅助细胞的新亚型，它不同于Th1细胞和Th2细胞。低氧诱导因子(hypoxia-inducible factors，HIFs)是低氧反应的氧感知信号途径中的关键分子，能介导低氧性肺血管改建等多种低氧反应。HIF-1的上调与激活可促进幼稚T细胞(Na(i)ve T cell)向Th17细胞分化，抑制其向Treg分化。HIF-1通过STAT3途径，可直接激活Th17细胞的特异性转录因子维甲酸相关孤独受体（RORγt），并参与调控Th17的功能。
　　白介素-17(Interleukin-17)是Th17细胞的主要效应因子，促进炎症反应是IL-17的主要生物学效应。IL-17在促进T细胞活化、募集及活化中性粒细胞中具有重要作用，其次，IL-17还能刺激纤维细胞与成纤维细胞的增殖，以此来增加胶原沉积，介导组织炎症反应。近年来，多项研究表明，已在慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘(Asthma)等慢性炎症性疾病和多种自身免疫性疾病中发现了Th17细胞的身影，并在其中发挥着关键作用。
　　因此，本研究采用低压低氧暴露复制小鼠HPH模型，利用该动物模型，探讨低压低氧暴露后Th17细胞的变化特点及其与肺血管改建之间的关系。以更深一步揭示HPH及其发病机制，为寻求关键有效的HPH防治靶点提供线索和依据。
　　方法:
　　1.动物分组
　　雄性Balb/c小鼠50只，按低氧暴露时间差异随机分为5组，每组10只。低压低氧组小鼠分别置与模拟海拔6000m的低压舱内饲养3、7、14、28 d。常氧组即0d组，置常压常氧环境下饲养。动物常规饲养，实验前12h禁食，自由饮水。采用持续性低压低氧方法复制HPH模型，即低氧处理组小鼠置于低压氧舱内24h连续低压低氧处理不同时间后检测所需指标。
　　2.检测方法
　　于相应时间点通过心导管检测右室收缩压(RVSP)，随后快速处死取材，测量右心室重量(RVHI)指数;Masson染色肺组织石蜡切片，观察肺血管改建及细胞外基质沉积情况;流式细胞术检测脾脏组织及肺组织中Th17细胞(CD4+IL-17+RORγt+)所占比例变化;ELISA检测血清中IL-4、IL-6、IL-17水平及肺组织中IL-17水平变化;Western blot检测肺组织中RORγt蛋白表达情况;RT2-PCR检测肺组织RORγt的mRNA表达水平。
　　结果:
　　1.RVSP及RVHI的变化
　　RVSP及RVHI检测结果表明，低氧暴露7d、14d、28 d后小鼠右心室收缩压(RVSP)和右心肥厚指数(RVHI)明显高于对照组。差异显著且具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。
　　2.小鼠血清细胞因子的变化
　　ELISA检测结果显示，低压低氧后各组小鼠血清IL-4、IL-6水平较常氧对照组明显升高，其差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。低压低氧7d、14 d、28 d组血清的IL-17水平与常氧对照组相比显著升高，且差异有统计学意义(P＜0.01)。
　　3.脾脏组织Th17细胞比例的变化
　　流式细胞术结果显示，在低氧诱导下，脾脏组织中IL-17+ RORγt+CD4+T细胞百分比随缺氧时间的增长呈上升趋势，14 d、28 d组与对照组差异显著且有统计学意义(P＜0.01)。
　　4.肺组织RORγt的mRNA水平
　　RT2-PCR结果显示，在低氧诱导下，肺组织中RORγt的mRNA表达明显升高，7d、14d、28 d组与常氧对照组相比有差异，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。
　　5.肺组织IL-17水平
　　ELISA结果显示，低氧暴露14d、28 d组与对常氧照组相比，肺组织中IL-17水平显著升高，且差异有统计学意义（P＜0.01）。
　　6.肺组织RORγt蛋白水平表达升高
　　Western blot结果可以看出，低氧诱导下，肺组织中RORγt的蛋白表达水平升高，与对照组相比有差异且差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。
　　7.肺组织Th17细胞比例的变化
　　流式细胞术结果显示，在低氧诱导下，肺组织中Th17细胞的水平明显呈上升趋势，与对照组相比显著升高，且差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。
　　8.相关性分析
　　肺组织中RORγt的mRNA表达水平、IL-17表达量与心室收缩压、右室肥厚指数呈显著正相关。
　　结论:
　　1.低压低氧可使脾脏Na(i)ve T细胞向Th17分化。
　　2.肺组织中RORγt的mRNA表达水平及IL-17水平显著升高。提示低压低氧时肺组织中浸润的Th17细胞增多。
　　3.小鼠在模拟海拔6000 m低压低氧环境生存7d即可造成RVSP和数RVHI明显升高，肺血管周围沉积的胶原纤维增多。
　　4.低压低氧时浸润至肺组织的Th17细胞与肺血管改建及HPH的发生有关。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 低压低氧时肺血管改建与IL-17的关系

2．1 材料与方法

2．2 实验结果

2．3 讨论

第三章 低压低氧暴露后脾脏组织Th17细胞的变化特点

3．1 材料与方法

3．2 实验结果

3．3 讨论

第四章 低压低氧时小鼠血清Th17相关因子的变化特点

4．1 材料与方法

4．2 实验结果

4．3 讨论

第五章 低压低氧时肺组织Th17细胞的变化特点及其与肺血管改建的关系

5．1 材料与方法

5．2 实验结果

5．3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述 Th17细胞在炎症反应中的作用

攻读硕士期间发表的文章

致谢