胰岛素抵抗状态下Betatrophin基因的表达变化及对相关信号通路的影响

摘要

本文分析了胰岛素抵抗状态下Betatrophin基因的表达变化及对相关信号通路的影响。本研究分为三个部分：
　　第一部分：小鼠Betatrophin基因表达载体构建及鉴定。
　　目的：构建小鼠Betatrophin基因重组质粒（pIRES2-EGFP-Betatrophin），并用于C57BL/6J小鼠的原代肝细胞转染。
　　方法：提取小鼠肝脏组织Total RNA，经逆转录（RT-PCR）获得cDNA。后续PCR扩增得到Betatrophin CDS序列全长。经双酶切,连接到真核表达载体pIRES2-EGFP上，构建成pIRES2-EGFP-Betatrophin，后续通过双酶切+凝胶电泳、DNA测序、Blast对重组质粒进行鉴定。
　　结果：将重组质粒（pIRES2-EGFP-Betatrophin）和经过双酶切的重组质粒进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像后前者（pIRES2-EGFP-Betatrophin重组质粒）出现在对应Marker5897bp的位置；后者出现两条线性化条带，分别在对应Marker597bp（Betatrophin CDS全长序列）位置和5.3kb（pIRES2-EGFP线性条带）位置，初步确定重组质粒构建成功。测序结果同Genbank中Betatrophin mRNA所编码的 CDS序列全长在NCBI中进行DNA序列比对，比对结果完全一致，证明所克隆的基因就是小鼠Betatrophin cDNA。
　　结论：成功构建真核表达载体pIRES2-EGFP-Betatrophin。
　　第二部分：Betatrophin在小鼠组织中的表达。
　　目的：探索普食、高脂喂养的C57BL/6J小鼠组织中，Betatrophin mRNA和蛋白表达差异。
　　方法：取高脂饲料喂养（HFD）28周的C57BL/6J小鼠（5只）、普食喂养（SD）的同龄C57BL/6J小鼠（5只）处死取肝脏、脂肪组织于液氮中保存，后续提取各对应组织RNA并逆转录为cDNA，再通过实时定量荧光PCR测定Betatrophin的mRNA表达差异；提取各对应组织总蛋白，通过Western blot方法测定Betatrophin的蛋白表达差异。
　　结果：Betatrophin mRNA和蛋白表达量在 HFD小鼠的肝脏和脂肪组织中明显高于（p<0.05或p<0.01）SD小鼠对应组织；
　　结论：提示Betatrophin的表达可能与小鼠机体的胰岛素抵抗相关。
　　第三部分：Betatrophin在肝细胞中的表达及其对胰岛素信号通路的影响。
　　目的：探索胰岛素抵抗状态的小鼠肝原代细胞Betatrophin基因表达情况，以及Betatrophin过表达对增加小鼠肝细胞胰岛素抵抗的机制。
　　方法：分离C57BL/6J小鼠原代肝细胞，分组培养。使用浓度递增的胰岛素处理；经一定浓度胰岛素处理24h的原代肝细胞再通过罗格列酮或者二甲双胍作用，通过定量PCR及Western blot检测Betatrophin表达。原代肝细胞和巨噬细胞RAW264.7共培养；另外组使用罗格列酮或者二甲双胍处理共培养体系细胞，通过定量PCR及Western blot检测Betatrophin表达情况；另外各组原代肝细胞分别加2％（在培养基中所占体积比）的PBS(空白对照)、正常人血清（normal）、PCOS患者未治疗者血清(Before metformin)、PCOS患者二甲双胍治疗3个月血清(3 months after metformin)、PCOS患者二甲双胍治疗6个月的血清(6 months after metformin)培养24小时，再通过定量PCR及Western blot检测Betatrophin、P-InsR以及P-AKT表达；最后用过表达质粒以及干扰RNA转染小鼠肝原代细胞48h，定量PCR以及Western blot检测Betatrophin、 P-InsR以及P-AKT表达情况。
　　结果：随着insulin浓度梯度的增加，insulin处理的肝原代Betatrophin表达逐渐增高（p<0.05或p<0.01），同时经一定浓度insulin作用24h的肝原代细胞再用不同浓度罗格列酮或者二甲双胍处理后Betatrophin表达显著下降（p<0.05或p<0.01）；肝原代细胞、巨噬细胞264.7共培养体系在经罗格列酮或者二甲双胍作用后Betatrophin表达显著降低（p<0.05或p<0.01）；Betatrophin过表达组的P-InsR、P-AKT表达同对照组比明显降低（p<0.01），Betatrophin干扰组的P-InsR、P-AKT表达相对于对照组显著升高（p<0.01）。
　　结论：Betatrophin表达与胰岛素抵抗相关，Betatrophin基因过表达可能抑制了PI3K/Akt信号通路，降低胰岛素敏感性，从而增强肝细胞胰岛素抵抗。