KLF14基因表达改变对肝胰岛素抵抗及其相关信号通路的影响

摘要

第一部分KLF14基因mRNA及蛋白在小鼠及人类代谢相关组织中的表达
　　目的:观察KLF14基因mRNA及蛋白在C57BL/6J、HFD-C57BL/6J、db/db小鼠及正常人、T2DM患者代谢相关组织中的表达情况。
　　方法：提取小鼠肝脏、脂肪、肌肉组织及正常人、T2DM病人脂肪、肌肉组织的RNA和蛋白。RNA经逆转录为cDNA，然后通过实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测KLF14基因mRNA在各组织中的表达情况。采用Western blot检测KLF14蛋白在各组织的表达情况。
　　结果：KLF14 mRNA和蛋白在HFD-C57BL/6J、db/db小鼠肝脏、脂肪、肌肉组织中的表达明显低于C57BL/6J（P<0.01）；而且在T2DM病人中脂肪和肌肉中 KLF14 mRNA和蛋白的表达也明显低于正常人（P<0.01）。
　　结论: KLF14 mRNA和蛋白在 HFD-C57BL/6J、db/db小鼠及T2DM病人代谢相关组织中表达明显偏低，提示KLF14可能在代谢相关疾病中发挥重要作用。
　　第二部分 KLF14基因表达变化对胰岛素信号通路中信号分子的影响
　　目的:探讨KLF14基因过表达对PI3K/Akt信号通路中关键信号分子的影响。
　　方法：采用pIRES2-KLF14质粒转染Hepa1-6细胞建立KLF14过表达模型。利用[3H]-2-脱氧-D-葡萄糖摄取法检测Hepa1-6细胞对葡萄糖的摄取作用；采用Western blot检测PI3K/Akt信号通路中p-InsR/InsR、p-IRS1/IRS1、p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β的蛋白表达水平。
　　结果：在胰岛素（100nM）刺激下，KLF14过表达明显上调细胞葡萄糖摄取率（P<0.05），p-InsR、p-IRS1、p-Akt、p-GSK3β的磷酸化水平显著增强（P<0.05或P<0.01）。给予PI3K抑制剂（LY294002）作用后，细胞葡萄糖摄取率及p-Akt、p-GSK3β的磷酸化水平明显下降（P<0.01）。
　　结论：KLF14可能通过激活胰岛素经典通路——PI3K/Akt信号通路增加胰岛素敏感性，改善肝细胞胰岛素抵抗。
　　第三部分 KLF14基因过表达改善肝细胞胰岛素抵抗及其相关机制研究
　　目的：探讨KLF14基因过表达改善肝细胞胰岛素抵抗及其可能的分子机制研究
　　方法：采用一定高浓度胰岛素和（或）葡萄糖作用于Hepa1-6小鼠肝癌细胞，构建肝细胞胰岛素抵抗模型；采用MTT法检测细胞活率；运用KLF14过表达质粒pIRES2-KLF14上调肝细胞KLF14表达；采用[3H]-2-脱氧-D-葡萄糖摄取法检测Hepa1-6细胞对葡萄糖的摄取作用；采用Western blot检测胰岛素信号通路中p-Akt/Akt蛋白表达水平。
　　结果：给予Hepa1-6细胞高浓度胰岛素（10-8M）、葡萄糖（25mM）作用24小时，Hepa1-6细胞葡萄糖摄取率及p-Akt表达明显下降（P<0.01）;然而，在胰岛素（100nM）刺激下，将细胞KLF14基因表达上调可明显改善高浓度胰岛素和（或）高浓度葡萄糖作用引起的葡萄糖摄取率及p-Akt表达下降（P<0.05或 P<0.01），而在给予细胞PI3K抑制剂（LY294002）之后，葡萄糖摄取率及p-Akt水平明显降低（P<0.05 or P<0.01）。另外，采用正常人及T2DM病人血清分别作用Hepa1-6细胞24小时，在胰岛素（100nM）刺激下，T2DM病人血清可使细胞葡萄糖糖摄取率及p-Akt水平明显降低，差别具有统计学意义（P<0.05 orP<0.01）,当pIRES2-KLF14质粒转染细胞后，细胞葡萄糖糖摄取率及p-Akt水平明显得到改善（P<0.05），而LY294002则可显著降低KLF14的作用（P<0.05 or P<0.01）。
　　结论：KLF14基因过表达可能通过活化PI3K/Akt信号通路，增加胰岛素敏感性，从而改善肝细胞胰岛素抵抗。

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英文摘要

前言

第一部分 KLF14基因mRNA及蛋白在小鼠及人类代谢相关组织中的表达

1. 材料与方法

2 结果

3 讨论

附图

第二部分 KLF14基因表达变化对胰岛素信号通路中信号分子的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

附图

第三部分 KLF14基因过表达改善肝细胞胰岛素抵抗及其相关机制研究

1. 材料与方法

2 结果

3 讨论

附图

参考文献

全文总结

文献综述: Akt/PKB激活与胰岛素信号通路：T2DM治疗的新方向

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文