胞质NPM1突变蛋白稳定丙酮酸激酶增强白血病细胞有氧糖酵解表型

摘要

目的：肿瘤细胞的有氧糖酵解能够促进其恶性转化，目前已知多种基因可参与调控该过程。核仁磷酸蛋白（nucleophosmin, NPM1）是急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）中最常见的基因突变，对AML的发生、治疗以及预后有重要影响。然而，NPM1突变在AML有氧糖酵解表型中的调控作用尚未阐明。本文探讨NPM1突变对AML有氧糖酵解表型的影响及相关分子机制，进一步观察有氧糖酵解表型对NPM1突变AML细胞体外增殖能力的影响。
　　方法：采用基因过表达的方法，在白血病细胞株THP-1中过表达NPM1 A型突变蛋白（NPM1-mA），观察NPM1-mA对白血病细胞糖酵解表型的影响。采用慢病毒RNA干扰的方法，感染天然携带NPM1-mA的白血病细胞株OCI/AML3后，观察干扰NPM1-mA对白血病细胞糖酵解表型的影响。qRT-PCR和Western blot方法检测髓系白血病细胞株中NPM1-mA基因和蛋白的表达。Glucose Assay Kit和Lactate Assay Kit试剂盒检测培养基中葡萄糖消耗量和乳酸生成量。利用2',7'-Dichlorofluorescin Diacetate（ DCF-DA）探针检测细胞内活性氧（ROS）水平。在 OCI/AML3细胞中，利用免疫共沉淀（IP）联合质谱检测（MS）技术筛选出与NPM1-mA蛋白相互作用的糖酵解相关蛋白。通过内源性 Co-IP实验验证蛋白间的相互作用。免疫荧光实验验证NPM1-mA与糖酵解相关目的蛋白（PKM2）的亚细胞共定位。进一步利用放线菌酮处理OCI/AML3细胞，检测PKM2的蛋白稳定性变化。之后，采用 RNA干扰和过表达方法调控 PKM2蛋白表达，观察NPM1-mA白血病细胞糖酵解水平的改变。通过CCK-8法和克隆形成实验进一步观察PKM2对NPM1-mA白血病细胞体外增殖能力的影响。
　　结果：成功建立NPM1-mA过表达的 THP-1细胞株，NPM1-mA组细胞糖酵解水平上升（p<0.05），ROS水平下调（p<0.05）；而干扰NPM1-mA的OCI/AML3细胞株中，sh-NPM1组细胞糖酵解水平下降（p<0.05），ROS水平上调（p<0.05）。IP联合MS筛选出与NPM1-mA蛋白相互作用的两种糖酵解关键酶（PFKL和PKM2）。采用Western blot方法在6株白血病细胞株中检测PFKL和PKM2蛋白表达水平，结果发现PKM2蛋白高表达而PFKL蛋白表达水平难以检测。细胞内Co-IP实验证实了NPM1-mA蛋白与PKM2蛋白的相互作用，且二者共定位于细胞质中。过表达NPM1-mA促进PKM2蛋白水平，而干扰NPM1-mA则下调PKM2蛋白水平，同时细胞内PKM2蛋白的稳定性下降。此外，干扰OCI/AML3细胞株PKM2的表达，结果发现sh-PKM2组细胞糖酵解水平下降（p<0.05），ROS水平上调（p<0.05）。若在NPM1-mA下调的OCI/AML3细胞株中恢复PKM2的表达，则发现白血病细胞的糖酵解水平上升（p<0.05），ROS水平下调（p<0.05）。另外，sh-PKM2组细胞增殖能力和克隆形成能力明显降低（p<0.05），而恢复PKM2表达的 Flag-PKM2组细胞的细胞增殖能力和克隆形成能力明显增强（p<0.05）。
　　结论：NPM1-mA参与调控白血病细胞的高糖酵解表型。移位至胞质中的 NPM1-mA蛋白可与糖酵解关键限速酶 PKM2结合并稳定PKM2蛋白分子。PKM2介导的高糖酵解水平增强了白血病细胞的体外增殖能力。靶向PKM2抑制糖酵解水平可能成为携带NPM1突变白血病临床治疗研究的一种新策略。

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前言

第一部分 NPM1突变蛋白参与调控白血病细胞的有氧糖酵解

1材料与方法

2结果

3讨论

第二部分 NPM1突变蛋白稳定糖酵解关键酶PKM2

1材料与方法

2结果

3讨论

第三部分 PKM2介导的糖酵解在白血病细胞生长中的作用

1材料与方法

2结果

3讨论

全文总结

参考文献

文献综述: 调控丙酮酸激酶的机制研究现状

致谢

攻读硕士期间发表的文章及相关课题