ALEX1 在宫颈癌组织中的表达及其对细胞生物学特性的影响

摘要

宫颈癌是一种严重影响女性身心健康的疾病，据世界卫生组织报告发病率占所有癌症的12％,仅次于乳腺癌。ALEX1(Arm proteins lost in epithelial cancers on chromosome X1)蛋白是Arm重复蛋白家族成员之一，蛋白序列中含有两个 Armadillo repeat结构，在蛋白 N端具有一个疏水的跨膜区。ALEX1在正常组织中除肝脏、胸腺组织低表达，外周血白细胞未见表达外均有广泛的表达；在上皮组织来源的肿瘤组织中低表达或不表达。有关报道也证明 ALEX1参与肿瘤的发生发展，过表达 ALEX1能抑制直肠癌细胞的克隆形成。但有关 ALEX1在宫颈癌中的作用尚未见报道。本论文将探讨 ALEX1在宫颈癌组织中的表达情况，并研究其对宫颈癌细胞的相关生物学行为的影响。
　　第一部分ALEX1在宫颈癌组织中的表达及其临床意义
　　目的：研究 ALEX1蛋白在宫颈癌临床组织与癌旁组织中的表达差异，并分析其表达差异与其临床意义。
　　方法：收集53对临床宫颈癌和癌旁组织，多聚甲醛固定，乙醇脱水，石蜡包埋及切片，应用免疫组化检测临床宫颈癌组织与癌旁组织中 ALEX1的表达差异，并分析其临床特性对 ALEX1的表达影响。
　　结果：在53例宫颈癌组织中有44例组织标本高表达 ALEX1蛋白(83.0%)；在53例癌旁组织中有13例组织标本高表达 ALEX1蛋白(24.5%)（*P＜0.05）；此外，在癌旁组织中 ALEX1的表达主要定位在细胞核中，而在癌组织中 ALEX1的表达主要定位在细胞质中。
　　结论：ALEX1基因在宫颈癌组织中表达高，而在癌旁组织中低表达；在癌旁组织中ALEX1蛋白的表达主要为核质表达，而在癌组织中 ALEX1蛋白的表达主要为胞质表达。
　　第二部分干扰 ALEX1对宫颈癌细胞 Hela增殖、周期及凋亡的影响
　　目的：设计针对 ALEX1的干扰RNA，并探讨干扰 ALEX1对宫颈癌细胞株 Hela生物学特性的影响。
　　方法：设计并合成三条针对 ALEX1基因的小干扰 RNA，转染宫颈癌细胞株 Hela细胞，并筛选出最佳干扰序列。通过流式细胞仪检测沉默 ALEX1对宫颈癌细胞 Hela的周期、凋亡变化情况，利用CCK-8检测沉默 ALEX1对宫颈癌 Hela增殖情况的影响。
　　结果：实时荧光定量 PCR和 Western blot检测结果显示，三组小干扰 RNA序列中 RNAi-3对宫颈癌细胞 Hela干扰效果最佳。流式周期和凋亡检测显示：ALEX1沉默组中 S期细胞比例（30.00±1.77%）较未处理组（16.53±0.93%）和阴性对照组（14.41±0.86%）中 S期细胞比例显著升高（*P＜0.05）；ALEX1沉默组中细胞凋亡率（16.41±0.59%）较未处理组（2.31±0.23%）和阴性对照组（3.15±0.33%）中细胞凋亡率显著升高（*P＜0.05）。CCK-8检测结果显示：ALEX1沉默组相对未处理组和阴性对照组在72、96 h细胞生长明显受到抑制（*P＜0.05）。
　　结论：沉默 ALEX1的表达能促进人宫颈癌细胞 Hela的凋亡和阻滞细胞周期的进程并抑制其细胞增殖。
　　第三部分沉默 ALEX1增强 Res对宫颈癌细胞的敏感性
　　目的：研究沉默 ALEX1后抗癌药物 Res对宫颈癌细胞存活率及细胞凋亡率的影响，并测定不同时间 Res处理后，其IC50的变化。
　　方法：利用 CCK-8检测沉默 ALEX1宫颈癌对抗癌药物 Res敏感性的影响，Res浓度设定为0、50、100、200、400、600、800μmol· L-1。
　　结果：ALEX1沉默组经抗癌药物 Res处理后相对空白组和阴性对照组经 Res抗癌药物处理后细胞生长显著受到抑制；且在处理48、72 h后，AEX1沉默组与阴性对照组和空白对照组的 IC50有显著降低；流式细胞仪检测凋亡率结果显示，siRNA转染 Hela细胞24 h后用浓度为300μmol· L-1的 Res处理细胞48 h中，沉默组Hela细胞凋亡率(36.33±3.17%)比例显著高于阴性对照组(16.58±1.95%)和空白组(12.28±1.28%)中细胞凋亡率(*P＜0.05)。
　　结论：沉默 ALEX1在48、72 h时增强了 Res对宫颈癌的致死能力，提高了Res对宫颈癌的药物敏感性；沉默ALEX1表达后，增强了 Res促进 Hela细胞凋亡的发生。

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英汉缩略语名词对照

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前言

第一部分 ALEX1在宫颈癌组织中的表达及其临床意义

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 ALEX1在宫颈癌中高表达

2.1 ALEX1在宫颈癌中主要表达于细胞核

3 讨论

第二部分 干扰 ALEX1 对宫颈癌细胞 Hela 增殖、周期及凋亡的影响

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 PCR 检测 siRNA 对 ALEX1 的干扰效率

2.2 siRNA 对 ALEX1 干扰效率的检测

2.3 沉默 ALEX1 基因表达，检测 Hela 细胞周期变化

2.4 沉默 ALEX1 基因表达，检测 Hela 细胞凋亡变化

2.5 沉默 ALEX1 基因表达，检测 Hela 细胞增殖变化

3 讨论

第三部分 沉默 ALEX1 增强 Res 对宫颈癌细胞敏感性

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 CCK-8测定 Res 对Hela 细胞生长及 IC50 的测定

2.2 流式细胞仪检测 Res 对Hela 细胞凋亡率

3 结论

全文总结

参考文献

文献综述: ARM 家族蛋白及相关蛋白的研究进展

致谢

攻读硕士期间发表的论文