通过16SrRNA序列分析探讨抑郁症与肠道菌群之间的相互联系

摘要

背景：抑郁症是一种基因与环境相互作用的复杂精神疾病，严重危及人类健康；其患病率达15％，占全球疾病负担的12.3%。WHO预测到2020年，抑郁症将成为危害人类健康的第二大疾病。因此，加强抑郁症预防、治疗以及发病机制的研究迫在眉睫。抑郁症发病机制学说众多，主要聚焦于脑内分子异常学说，包括神经传递缺乏、神经营养障碍、内分泌免疫以及神经解剖学等的异常。这些脑内异常学说为揭示抑郁症的病因提供了一定的理论依据，但大都只能解释某些方面的原因。例如，临床基于脑内单胺类神经递质失衡学说而开展的抗抑郁治疗仅能使40%病人症状缓解。据此可见，抑郁症发病机制中脑内因素固然重要，但外环境因素及其作用机制更亟待阐明。人体内肠道微生物细胞的数量是人体内细胞数量的9倍,其基因总量约是人自身基因数目的150倍。因此，肠道微生物被认为是人体最大、最直接的外环境，对维持人体健康发挥着重要作用。新近研究表明，肠道微生物能通过“微生物-肠-脑”轴来影响大脑神经神经生化和行为表型。课题组前期抑郁症代谢组学研究，发现抑郁症患者伴有肠道微生物源的代谢物（例如马尿酸盐，二甲胺和二甲基甘氨酸）紊乱，提示肠道微生物紊乱可能是抑郁症的一个重要特征，亟待阐明。
　　目的：采用16SrRNA基因测序方法，通过比较58例抑郁症患者和63例健康对照组的粪便中肠道微生物的构成，评估抑郁症患者中肠道微生物是否发生了显著性的改变，其紊乱的关键肠道微生物是什么，为深入研究肠道微生物与抑郁症发病的关键奠定基础。
　　方法：⑴采用DSM-IV--TR标准进行抑郁症的诊断以及17项汉密尔顿抑郁评分量表(HDRS)来用于量化抑郁症的严重性。共纳入58名抑郁症患者和63名匹配的健康正常对照。在纳入的抑郁患者中，大多数（n=39）为未用药抑郁患者，其余（n=19）正服用各种抗抑郁药物。⑵从所招募的受试者中收集粪便标本后，迅速将标本冰冻并保存在-80℃冰箱内，便于后续实验。在液态氮中用研钵和杵将粪便样品粉碎，用标准的DNA提取试剂盒获得细菌基因组DNA。⑶罗氏454测序：将提取的16S rRNA基因中的V3-V5区域片段利用通用引物进行PCR扩增。从454测序获得的原始序列使用 Mothur版本1.31.2(http://www.mothur.org/)进行质量筛选获得独特的读取片段。不到200bp序列和大于1000 bp序列以及含有引物错配，条形不匹配，模棱两可的碱基序列，均聚物运行超过6个基地的序列均被排除在外。剩余所有序列按照97%阈值以成对匹配的方式分配到操作分类单元（ OTUs）,使用 RDP参考数据库(http://www.mothur.org/wiki/RDP_reference_files)进行分类。这些分类法通过总结各个操作分类单元（OTUs）的分布，可用于计算不同级别的菌群的相对丰度。菌群的α多样性采用四种不同的参数进行计算(i)观察物种;(ii) Shannon多样性指数;(iii)系统发育多样性；(iv) Simpson。β多样性即样本之间的距离多样性，根据主坐标分析(PCoA)基于加权和非加权(未加权的UniFrac)算法。执行UniFrac分析时,使用PyNAST代表每个OTU序列是一致的，从这种一致的系统建成发育树。随机森林算法是通过评估每个 OTU偏离预测值的误差增长程度来给每个 OTU分配一个重要的分数，我们采用这种算法来鉴定出关键性的OTU。
　　结果：①以16S核糖体RNA基因序列为基础的测序方法，用来比较MDD患者和健康对照组的肠道微生物群落。从他们的粪便样本中提取DNA，我们共获得854639个高质量的16S rRNA基因序列（7063±2352读取/粪便样本），随后在97%的相似性水平上被分为操作分类单元（OTUs）。这些OTUs多数属于两门菌种（厚壁菌门和拟杆菌门；83.1%±11.9%）。②菌群的α多样性表明两组之间无显著性差异；而进一步研究表明肠道菌群的β多样性（加权UniFrac分析）即微生物系统发育的相似程度在MDD与健康人之间存在着不同。未加权的UniFrac分析三维图显示在MDD患者和健康对照组之间肠道微生物群落有明显的差异。利用加权 UniFrac分析也观察到抑郁症患者和健康对照组之间的类似的区别。混杂因素，包括分类变量（例如，性别、吸烟状态和抗抑郁药的使用）与连续变量（年龄、体重指数）未显著影响肠道微生物的表型。③采用随机森林，共鉴定出54个OTUs，其相对丰度能够可靠的鉴别抑郁症和健康对照的样本。在这54个 OTUs中，有29个 OTUs的丰度在抑郁症患者中高表达，主要归属于：放线菌亚目，棒状杆菌，乳酸杆菌，链球菌，梭菌XI(Parvimonas)，优杆菌，毛螺旋菌（Anaerostipes, Blautia, Dorea, Lachnospiracea incertae sedis），疣微菌科（梭菌属 IV）， Erysipelotrichaceae incertae sedis；有25个OTUs的丰度在正常人中高表达，主要归属于：拟杆菌，理炎菌（Alistipes），毛螺旋菌（Coprococcus, Clostridium XlVa, Lachnospiracea incertae sedis, Roseburia, and Faecalibacterium），氨基酸球菌（考拉杆菌），韦荣球菌（巨单胞菌）和Sutterellaceae。在门的水平,这些显著差异的OTUs主要集中在厚壁菌(45/56,76.7%),放线菌(5/56,10.9%)和拟杆菌(3/56,5.3%)。与健康对照组相比,抑郁症患者的放线菌的相对丰度增加,而拟杆菌的相对丰富减少。虽然厚壁菌在抑郁症患者和健康对照组中总体相对丰度没有明显差异,但是仍是抑郁症中标志性改变的肠道微生物。这是因为厚壁菌中的一些OTUs的丰度(24/56)在抑郁患者中高表达,而其他OTUs在抑郁患者中则表达降低。综上，我们发现抑郁症患者伴有显著的肠道菌群的紊乱，而这些失调的微生物主要集中在厚壁菌,放线菌,拟杆菌这三种细菌。
　　结论：在抑郁症患者与健康正常人中，肠道微生物群的构成存在着显著的改变和差异。与健康对照组相比，放线菌的相对丰度在抑郁症患者中的表达增加，而拟杆菌的表达减少。此外,我们还发现,厚壁菌也能鉴别抑郁症患者和健康对照组,虽然整体的厚壁菌并没有在两组之间的相对丰度中发现显著差异。我们的研究采用高同质性的临床生物样本，率先提供了抑郁症伴有肠道微生物紊乱的直接证据，为下一步深入研究肠道微生物在抑郁症发生中的作用奠定了基础，为解析抑郁症的新发病机制提供一个全新的切入点。

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前言

1材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器

1.1.2试剂

1.2方法

1.2.1研究对象

1.2.2标本采集

1.2.3 DNA的提取

1.2.4 DNA样本纯度以及浓度测定

1.2.5 PCR扩增及产物纯化

1.2.6基因测序

1.2.7基因序列分析

2 结果

2.1 研究对象

2.2 两组粪便标本PCR扩增所得到的16S rRNA序列数据

2.3α多样性检测表明抑郁症患者与健康对照组的肠道菌群的分类并没有明显的差异性

2.4未加权的UniFrac分析三维图显示在MDD患者和健康对照组之间肠道微生物群落有明显的差异

2.5未加权的UniFrac的三维主坐标分析表明这些分类变量包括性别、吸烟、使用抗抑郁药没有显著影响观察到的抑郁症患者和健康对照组中肠道微生物群落的组成

2.6未加权的UniFrac的三维主坐标分析PCoA分析表明连续变量（年龄和BMI）与抑郁症患者和健康对照组的肠道微生物群落的组成差异并没有显著相关性

2.7抑郁症患者和健康对照组的肠道微生物群落的差异主要集中在厚壁菌，放线菌和拟杆菌。

3讨论

全文总结

参考文献

文献综述:肠道微生物与抑郁症的研究进展

致谢

硕士期间发表论文