CD40/CD40L信号通路调控调节性B细胞在HSP和HSPN中的作用机制研究

摘要

本文对CD40/CD40L信号通路调控调节性B细胞在HSP和HSPN中的作用机制进行了研究。本研究分为两个部分：
　　第一部分：调节性B细胞对HSP和HSPN患儿Th17/Treg免疫平衡的影响。过敏性紫癜（HSP）是儿童时期最常见的自身免疫性血管炎，并发肾脏损害时称为紫癜性肾炎（HSPN）。大量研究显示CD4+T细胞亚群（Th1，Th2，Th17和Treg）功能紊乱参与儿童HSP的发生发展，包括 Th1/Th2的免疫失衡和 Th17/Treg的免疫失衡。同时，有研究指出Th17/Treg的免疫失衡与HSPN肾脏损害的严重程度密切相关。而目前尚无研究中心就不同肾脏累及程度的 HSPN患儿进行分组详细讨论Th17、Treg细胞比例及 Th17/Treg比值在其中的具体变化。调节性 B细胞作为一群能通过分泌IL-10调控CD4+T细胞免疫反应的负向调节性免疫细胞，参与影响Th17/Treg的免疫平衡，在多种自身免疫性疾病中得到了普遍研究，如系统性红斑狼疮（SLE），风湿性关节炎（RA），炎症性肠病（IBD）等，但是其在儿童 HSP及 HSPN中是否能影响Th17/Treg的免疫平衡，进而在 HSP的发生和HSPN肾脏损害及预后中发挥作用，目前尚不清楚。因此本研究通过检测HSP及HSPN患儿外周血Th17、Treg细胞的比例和Th17/Treg比值的变化，调节性B细胞及其两个亚群(CD19+CD24hiCD38hiB细胞和CD19+CD24hiCD27+B细胞)在其中的比例变化及其与Th17、Treg和Th17/Treg的相关性分析，初步探索调节性B细胞对Th17/Treg免疫平衡的影响。
　　目的：探讨调节性B细胞水平、功能异常可能通过影响Th17/Treg免疫平衡在HSP和HSPN的发生发展及转归中发挥作用。
　　方法：选取确诊的HSP及HSPN患儿76例，根据肾脏累及情况分为以下几组：无肾脏累及组20例（Group A），单纯镜下血尿组12例（Group B），单纯少量蛋白尿组17例（Group C），血尿合并少量蛋白尿组15例（Group D），大量蛋白尿组12例（Group E）；HSP/HSPN缓解期患儿（皮疹、腹痛、关节痛、血尿、蛋白尿等症状消失）16例（Group F），健康对照者16例（Control）。采用流式细胞术检测外周血中CD19+CD24hiCD38hiB细胞、CD19+CD24hiCD27+B细胞，Th17细胞和Treg细胞的百分比，以及CD19+B细胞、CD19+CD24hiCD38hiB细胞和CD19+CD24hiCD27+B细胞IL-10的表达水平；同时对B10细胞及其两个亚群与Th17细胞、Treg细胞和Th17/Treg的比值进行相关性分析。
　　结果：与Control组相比，Group A, B, C, D, E组中Th17细胞的比例明显升高（P<0.05）；Treg细胞的比例明显降低（P<0.05）；Th17/Treg的比值明显升高（P<0.05）；Group B, C, D, E中CD19+CD24hiCD38hiB细胞的比例和B10细胞、CD19+CD24hiCD38hiB、CD19+CD24hiCD27+B细胞分泌 IL-10的水平显著降低（ P<0.05）；Group D， E中CD19+CD24hiCD27+B细胞的比例显著降低（P<0.05）。与Group A相比， Group D, E中Th17细胞的比例、Th17/Treg的比值明显升高（P<0.05）；B10、CD19+CD24hiCD38hiB细胞的比例及分泌 IL-10的水平明显降低（P<0.05）；GroupE中Treg细胞、CD19+CD24hiCD27+B细胞及其IL-10的分泌水平显著降低（P<0.05）。Group F组中上述指标与 Control和Group A相比均无明显统计学差异（P>0.05）。B10、CD19+CD24hiCD38hiB和CD19+CD24hiCD27+B细胞与Th17细胞以及Th17/Treg的比值呈显著负相关（ P<0.05）， B10和 CD19+CD24hiCD38hiB细胞与CD4+CD25+Treg细胞呈显著正相关（P<0.05）。
　　结论：B10细胞及其两个亚群水平及功能异常（分泌IL-10的能力降低）可能参与HSP/HSPN的Th17/Treg免疫失衡。
　　第二部分：CD40/CD40L信号通路-调节性B细胞-Th17/Treg轴参与HSP和HSPN发生发展及转归。除了细胞免疫功能紊乱，大量研究表明HSP患儿体内也存在体液免疫功能紊乱，表现为血浆中IgA水平明显增高和血管壁IgA循环免疫复合物的沉积。而 CD40-CD40L，作为特异性免疫系统中重要的一对共刺激分子，其在诱导B细胞增殖、免疫球蛋白类型转换及抗体的合成和分泌中发挥重要作用，在机体的体液免疫和细胞免疫反应中均起重要作用。既往研究发现CD40L在HSP患儿外周血中表达异常增高，导致免疫球蛋白产生异常，进而在HSP的发生发展中起到重要作用。CD40/CD40L信号通路在B细胞调控T细胞介导的适应性免疫应答中发挥关键作用。CD40/CD40L相互作用促进 B细胞分泌 IL-10、TGF-β等抑制性细胞因子，从而抑制致病性的 T细胞的活化和分化，提示 CD40的表达与 B细胞的免疫调节功能密切相关。最近 Tedder等研究发现，B细胞在体外经CpG和CD40L共刺激48h后，能最大程度的诱导B10前体细胞向B10细胞分化，提示CD40/CD40L信号通路可能参与B10细胞的分化。然而，Liu等在人体B细胞中研究发现TLR通过介导STAT3和ERK的活化调控IL-10的分泌，BCR和CD40/CD40L与这一过程无关。所以，CD40/CD40L信号通路在B10细胞分化中的作用尚存在争议。因此本研究通过检测经 CD40L和 anti-CD40L mAb处理后PBMC中B10细胞及其两个亚群(CD19+CD24hiCD38hiB细胞和CD19+CD24hiCD27+B细胞)、Th17细胞、Treg细胞以及 B10细胞、CD19+CD24hiCD38hiB细胞和CD19+CD24hiCD27+B细胞分泌IL-10的水平变化，旨在探讨HSP及HSPN患儿体内CD40/CD40L信号通路在外周血B10细胞分化中的可能作用。
　　目的：探索CD40/CD40L信号通路异常是影响调节性B细胞水平及功能的关键。
　　方法：选取确诊的HSP和HSPN患儿76例，根据肾脏累及情况分为以下几组：无肾脏累及组20例（Group A），单纯镜下血尿组12例（Group B），单纯少量蛋白尿组17例（Group C），血尿合并少量蛋白尿组15例（Group D），大量蛋白尿组12例（Group E）；HSP缓解期患儿（皮疹、腹痛、关节痛、血尿、蛋白尿等症状消失）16例（Group F），健康对照者16例（Control）。利用流式细胞术检测外周血PBMC经LPS刺激7h后CD19+CD40+B细胞的比例以及其分泌IL-10的水平，检测经 CpG+CD40L刺激48h后 CD19+CD24hiCD38hiB细胞、CD19+CD24hiCD27+B细胞、Th17细胞和 Treg细胞的百分比，以及B10pro+B10细胞，CD19+CD24hiCD38hiB细胞、CD19+CD24hiCD27+B细胞分泌 IL-10的水平；检测 CpG+anti-CD40L mAb刺激48h后B10pro+B10细胞，Th17，Treg细胞的比例以及CD19+CD24hiCD38hiB细胞和CD19+CD24hiCD27+B细胞分泌IL-10的水平。
　　结果：与Control组相比，Group A, B, C, D, E组中CD19+CD40+B细胞的比例增高，但无统计学差异（P>0.05），Group B, C, D, E中CD19+CD40+B细胞分泌IL-10的水平明显降低（P<0.05）；Group F中CD19+CD40+B细胞的比例及其 IL-10的分泌水平无明显统计学差异（P>0.05）。CpG+CD40L刺激48h后 CD19+CD24hiCD38hiB细胞、CD19+CD24hiCD27+B细胞、Th17细胞、Treg细胞的比例、Th17/Treg的比值以及 B10pro+B10细胞、CD19+CD24hiCD38hiB细胞、CD19+CD24hiCD27+B细胞分泌IL-10的水平在Group A, B, C, D, E, F中均无统计学差异（ P>0.05）。与 CpG+CD40L刺激48h相比， CpG+anti-CD40L mAb刺激48h后， B10pro+B10细胞、CD19+CD24hiCD38hiB细胞、CD19+CD24hiCD27+B细胞分泌IL-10的水平和Treg的比例明显降低，Th17的比例和Th17/Treg的比值明显升高。
　　结论：CD40/CD40L信号通路异常介导B10细胞成熟及功能障碍，可能是HSP及HSPN患儿体内Th17/Treg免疫失衡的上游信号通路。同时，CD40/CD40L信号通路异常介导 B10细胞成熟及功能受损程度可能是HSP发生及HSPN肾脏损害程度的免疫学基础。

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英汉缩略语名词对照

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英文摘要

前言

参 考 文 献

第一部分：调节性B细胞对HSP和HSPN患儿Th17/Treg免疫平衡的影响

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

第二部分：CD40/CD40L信号通路-调节性B细胞-Th17/Treg轴参与HSP和HSPN发生发展及转归

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

全文总结

第一部分：调节性B细胞对HSP及HSPN患儿Th17/Treg免疫平衡的影响

第二部分：CD40/CD40L信号通路-调节性B细胞-Th17/Treg轴参与HSP和HSPN发生发展及转归

文献综述: 调节性B细胞在自身免疫性疾病中对CD4+T细胞的免疫调节作用

致谢

攻读博士学位期间的研究成果及发表的学术论文